外泌體尺寸排阻色譜分離管柱 qEV columns (SEC) [GMP-Ready]

外泌體尺寸排阻色譜分離管柱 qEV columns (SEC)

快速簡單、精準有效可自動化的外泌體分離提取純化管柱, 採用直接自然滴落方式超高純度移除背景可溶性蛋白, 完整保留原始的外泌體粒子。

符合 ISO13485:2016 醫療器材品質管理系統規範
只需自然滴落, 10-15分鐘完成 EV Seperation
最純淨無損的方式
最新發佈 qEV/20 nm, 與 qEV/35nm & qEV/70nm 完整覆蓋所有範圍
洗脫後可重複使用
搭配 AFC-V2 自動化操作
最新的獨家瓊脂糖樹脂填充配方(Gen 2)
最新推出"GMP Ready"管柱, 可得到符合內毒素/生物負荷度的外泌體粒子

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商品特色 qEV規格與訂貨資訊常見Q&A qEV 介紹與教學影片

近年來, 胞外體/細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的研究越來越引起相關生物學者的關注, 因為它們可擔任細胞間訊息傳導的角色: 包含免疫調節、細胞的活化與凋亡誘導以及在疾病狀態下的改變, EVs 的內容物有外泌體(Exosome, 外泌體/胞泌體)、微囊泡(Microvesicles)、外吐小體、胞外小體等。
因此, 如何提取和分析高含量與高純度的 EVs 就變成一個必要的過程(Exosomes/EVs isolation)。

還在用傳統的純化提取方法嗎?

傳統會使用的高速離心法(UC)或沉澱原理的試劑組(Precipitation Reagent Kits)常會遇到一些問題, 比如超高速離心的過程很花時間, 在 200,000 x g 的作用力下常會破壞囊泡或使囊泡團聚而影響後續的分析, 而使用密度梯度離心法 (Density gradient centrifugation, DGC) 會需要很昂貴的設備也很費時。

另外一個是目前市面上以沉澱原理的試劑組通常是基於PEG高分子聚合物而對沉積外泌體有選擇性, 但相關文獻早已指出這些試劑的成分很大可能會引起蛋白質、脂蛋白和其他生物成分的共沉澱現象出現, 等於是把雜質一起沉澱下來而大幅降低EV的純度值。

qEV與其他方式的比較

過程快速, 不需使用任何試劑(reagent)或高速離心的動作, 只用PBS直接自然滴落, 超高純度的完整保留粒子原始性, 臨床醫藥表現可防止免疫副反應出現

原理	提取方式	內容評價
UC超高速離心法	經由持續高速沉降或密度梯度差異提取	非常耗時, 設備昂貴, 人為操作變數大
PEG共沉澱法	利用高分子聚合物PEG將EV共同孵育後沉澱	專一性差, 會連同背景雜蛋白一起提取, 純度不佳
磁珠法	使用礠性親合方式結合EV後提取	磁珠也會和細胞碎屑結合, 形成干擾
抗體法	利用特定抗體與EV結合後提取	EV表面有多種的蛋白抗體, 特定抗體只會得到帶有此抗體的某些EV粒子
SEC法(qEV)	利用粒徑差異透過自然滴落得到EV粒子	只有qEV獲得ISO13485認證, 任何人都可以用AFC-V2自動化機台快速的得到高重複且高純度的EV

根據國際細胞外囊泡學會ISEV旗下權威JEV期刊發表的"對細胞上清液與人類血漿優化的外泌體提取方案": Richard J. Lobb et al. "Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma", Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27031 - http://dx.doi.org/10.3402/jev.v4.27031, 比較了qEV(SEC法), ExoQuick(PEG法), Exospin(PEG法), 並以TRPS技術分析粒徑濃度及BCA法測定蛋白背景純度, 得到結論為qEV是純度最好的方法, 這對於Exosome/EV外泌體的提取要求最為關鍵。

SEC 尺寸排阻色譜法

MISEV指南: 相對容易的使用方式, 可乾淨有效的分離EV粒子和背景雜蛋白粒子, 搭配AFC-V2自動系統就可減少人為之間的誤差

qEV columns 是基於 SEC (Size Exclusion Chromatography) 尺寸排阻色譜法, 又名凝膠過濾法(Gel Filtration) - 可提供快速簡單而精準有效的外泌體提取方式, 以"自然滴落"的方式在15分鐘內即可提取完整的外泌體純樣, 大粒徑的粒子會先流出, 相對的小粒徑粒子(20nm, 35nm或70nm以下)會進入到孔洞內而較晚流出, 比傳統的高速離心 (UC) 或沉澱試劑 (Precipitation Reagent Kits) 的方式更加能純淨、簡單、快速、精確而無損的提取外泌體粒子。

適合後續的下游分析例如Tunable Resistive Pulse Sensing, Electron Microscopy, Proteome or Transcriptome Analysis, 搭配 qEV Concentration Kit 和 qEV RNA Extraction Kit 更是串聯一體化的流程。

qEV columns 依照進樣體積的不同已經有 6 個型號 (150µL - 100mL), 每個型號都有20奈米、35奈米和70奈米共三種孔徑可以選擇, 可完全覆蓋您的原始樣品類型, 使用 PBS 或是其他生理緩衝液洗脫管柱後可重複使用, 現在, qEV 還可以選擇全球第一的自動餾份收集裝置 (AFC-V2, Automatic Fraction Collector)。

10-15分鐘完成提取 -- MISEV國際規範描述: 以尺寸為基礎來分離粒子且操作簡單的方式, 擁有更高的重複度結果
"SEC separates nanoparticles including EVs based on size" "Commercial columns are often packed under strictly controlled conditions and may allow more reproducible results than home-made columns." "concentration of a sample before or after SEC may be needed" "SEC is an easily accessible technique for size-based separation of particles." --- «最新國際研究規範 MISEV2023»

qEV (SEC) 的洗脫曲線

各種來源的生物樣品都適用: 血清、血漿、唾液、尿液、乳液、細胞培養上清液、CSF腦脊髓液、生物反應器等

最好的SEC純化管柱, 現在就選擇最新"Gen2"版本的qEV column吧

**全球唯一, 臨床化的最佳選擇**
標準化流程 + 自動提取有了 AFC-V2 外泌體自動餾份收集機, 可同時平行準確無誤的放大產出體積	生產過程品質可靠證明符合 ISO 13485:2016 醫療器材品質管理系統規範

Exosome 外泌體的國際金標準全面解決方案: qEV(SEC) + AFC(Auto) + Exoid(TRPS) is now the Gold Standard for exosome/EV isolation

從樣品的提取開始到定量分析結束, qEV(SEC) + AFC(Auto) + Exoid(TRPS)系統只要一小時內就可以完成, 是國際研究規範 MISEV 推薦的高純度+高解析度的標準化方式

根據國際細胞外囊泡學會ISEV旗下權威JEV期刊發表的"一個使用TRPS可調式電阻脈衝感應決定細胞外囊泡濃度的標準方式": Robert Vogel et al. "A standardized method to determine the concentration of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing", Journal of Extracellular Vesicles 2016, 5: 31242- http://dx.doi.org/10.3402/jev.v5.31242, 使用了qEV(SEC)和TRPS奈米粒徑分析定量, 是標準且精確符合Exosome/EV外泌體研究的國際規範內容。

如何選擇您的 qEV Gen 2 column 胞外體提取管柱? 只需三個步驟

第一步 : 依照樣品的體積 (Sample Loading) 選擇適合的型號

(*如原樣為細胞上清液, 需要先以 100 kDa Concentrator / TFF system 濃縮 30X-200X 的體積, 可提升數量濃度 & 降低qEV成本, 詳見"外泌體實驗知識與流程-如何從細胞上清液提取高純度的胞外體"或參閱對照表):

**qEV 進樣體積範圍**
qEVsingle (150 µL)		小體積生物樣品的理想選擇可用於AFC-V2自動提取單次使用 - 沒有RNA殘留
qEVoriginal (500 µL)		使用率最高的qEV管柱可用於AFC-V2自動提取可重複使用(最多不超過5次)
qEV1 (1 mL)		可用於AFC-V2自動提取可重複使用(最多不超過5次)
qEV2 (2 mL)		更大的臨床樣品體積量和下游RNA分析的準備封閉型管柱, 可用於AFC-V2自動提取可重複使用(最多不超過5次)
qEV10 (10 mL)		更大體積的細胞上清液的首選封閉型管柱, 可用於AFC-V2自動提取可重複使用(最多不超過5次)
qEV100 (100 mL)		工業化細胞上清液生產的選擇封閉型管柱, 可用於AFC-V2自動提取

**Cell Culture Media (CCM) 細胞上清液與qEV對照表**
濃縮前的CCM體積範圍	濃縮後的CCM體積 / 濃縮倍率	qEV的選擇	使用的濃縮裝置
< 15 mL	150 µL / 100 x	qEVsingle	100 kDa 離心過濾濃縮管
15 - 100 mL	500 µL / 30 x - 200 x	qEVoriginal
50 - 200 mL	1 mL / 50 x - 200 x	qEV1
100 - 300 mL	2 mL / 50 x - 150 x	qEV2	100 kDa TFF 切向流裝置 + 離心過濾濃縮管
300 - 1000 mL	10 mL / 30 x - 100 x	qEV10
4 - 5 L	100 mL / 40 x - 50 x	qEV100

**依照樣品類型, 推薦的qEV純化提取管柱和樣品製備方案**
樣品類型	樣品特徵	樣品體積	適合的qEV類型	樣品製備方案
細胞上清液(CCM) & 尿液(Urine)	大體積、低背景蛋白、低EV含量	150-1000 mL	qEV10	初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子前濃縮樣品至10 ml 使用qEV10 (如果需要可進行流洗後重複使用) 如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮
血漿和血清	變動的體積量、高背景蛋白、高EV含量	1-50 mL	qEV1 / qEV2 / qEV10	初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子使用qEV1或qEV2或qEV10 如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮 (如為高背景蛋白的樣品則不應該進行前濃縮步驟)
低黏度生物性流體	低體積、變動的EV和背景蛋白量	0.1-0.5 mL	qEVsingle / qEVoriginal	初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子使用qEVsingle或qEVoriginal 如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮
黏稠的生物性流體	低體積、變動的EV和背景蛋白量	0.1-0.5 mL	qEVsingle / qEVoriginal	將樣品懸浮於PBS內以降低黏度初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子使用qEVsingle或qEVoriginal 如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮

第二步: 選擇 20 nm、35 nm 或 70 nm 的孔徑

	最佳的回收範圍	說明
qEV / 20 nm	20-100 nm	粒徑下限最小; 適合Exomeres/Supermeres外泌超小體和AAVs腺相關病毒粒子
qEV / 35 nm	35-400 nm	適合提取小EVs粒子
qEV / 70 nm	70-1000 nm	粒徑範圍廣, 適合提取整體EVs的粒子, 數量濃度較多

第三步: 下游的WB, MS, qPCR分析?

1. 需要做蛋白分析? 繼續使用 "qEV Concentration Kit"
2. 需要做下游的EV-RNA分析? 繼續使用 "qEV RNA Extraction Kit"
3. 直接做粒徑分析? 那就使用最精準的 "Exoid (TRPS) 奈米粒徑/濃度/Zeta potential 膜電位分析儀"

**qEV型號/貨號對照表**
Gen 2 型號	貨號	進樣體積	使用方式	每盒數量(支)	AFC-V2自動提取機
qEVsingle / 20nm	ICS-20	150 µL	單次	20	V
qEVsingle / 35nm	ICS-35				V
qEVsingle / 70nm	ICS-70				V
qEVoriginal / 20nm	ICO-20	500 µL	洗脫後可重複, 建議5次	5	V
qEVoriginal / 35nm	ICO-35				V
qEVoriginal / 70nm	ICO-70				V
qEV1 / 20nm	IC1-20	1 mL	洗脫後可重複, 建議5次	5	V
qEV1 / 35nm	IC1-35				V
qEV1 / 70nm	IC1-70				V
qEV2 / 20nm	IC2-20	2 mL	洗脫後可重複, 建議5次	2	V
qEV2 / 35nm	IC2-35				V
qEV2 / 70nm	IC2-70				V
qEV10 / 20nm	IC10-20	10 mL	洗脫後可重複, 建議5次	1	V
qEV10 / 35nm	IC10-35				V
qEV10 / 70nm	IC10-70				V
qEV100 / 35nm	ICO-35-100	100 mL	洗脫後可重複, 建議5次	1	X
qEV100 / 70nm	ICO-70-100	100 mL	洗脫後可重複, 建議5次	1	X

**依照樣品類型, 推薦的qEV純化提取管柱和樣品製備方案**
樣品類型	樣品特徵	樣品體積	適合的qEV類型	樣品製備方案
細胞上清液(CCM) & 尿液(Urine)	大體積、低背景蛋白、低EV含量	150-1000 mL	qEV10	-初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子 -前濃縮樣品至10 ml -使用qEV10(如果需要可進行流洗後重複使用) -如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮
血漿和血清	變動的體積量、高背景蛋白、高EV含量	1-50 mL	qEV1 / qEV2 / qEV10	-初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子 -使用qEV1或qEV2或qEV10 -如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮 (如為高背景蛋白的樣品則不應該進行前濃縮步驟)
低黏度生物性流體	低體積、變動的EV和背景蛋白量	0.1-0.5 mL	qEVsingle / qEVoriginal	-初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子 -使用qEVsingle或qEVoriginal -如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮
黏稠的生物性流體	低體積、變動的EV和背景蛋白量	0.1-0.5 mL	qEVsingle / qEVoriginal	-將樣品懸浮於PBS內以降低黏度 -初步離心樣品以去除細胞、碎屑和大EV粒子 -使用qEVsingle或qEVoriginal -如果需要, 則將EV fractions合併後進行濃縮

**Cell Culture Media (CCM) 細胞上清液與qEV對照表**
濃縮前的CCM體積範圍	濃縮後的CCM體積 / 濃縮倍率	qEV的選擇	使用的濃縮裝置
< 15 mL	150 µL / 100 x	qEVsingle	100 kDa 離心過濾管
15 - 100 mL	500 µL / 30 x - 200 x	qEVoriginal
50 - 200 mL	1 mL / 50 x - 200 x	qEV1
100 - 300 mL	2 mL / 50 x - 150 x	qEV2	100 kDa TFF 切向流裝置 + 離心過濾管
300 - 1000 mL	10 mL / 30 x - 100 x	qEV10
4 - 5 L	100 mL / 40 x - 50 x	qEV100

1. 使用 qEV Columns 提取 Exosome/EVs 時需要做什麼前置作業嗎?

Ans: 採用SEC尺寸排阻色譜法的qEV Columns在使用前只需注意要先將樣品進行兩次步進的低速離心 - 1,500g/10mins, 將上清液移至新的離心管後, 再使用10,000g/10mins離心後取上清; 以上的目的是要去除樣品內的細胞碎屑或其他的大粒子, 之後即可放入 qEV Gen 2 columns 以自然滴落的方式得到Exosome/EVs的餾分(fractions)。

2. 已經使用過的qEV Columns要怎麼封存/保存呢? 所使用的Buffer有什麼注意事項呢?

Ans: 新的qEV Gen 2 olumns內含<0.1% ProClin 200用做抑菌劑 (with PBS)所以可於室溫下保存/運輸; 而已使用過並洗脫後的qEV column, 封存方式有三種:
方法1. 以0.05% w/v sodium azide或0.05% w/v ProClin 200(with PBS)封存, 可在室溫保存; 下次使用時一樣要先做"equilibrate"平衡的動作, 以2倍column體積的Buffer流洗管柱。
方法2. 以20% ethanol封存, 可在室溫保存; 因PBS如果直接接觸乙醇會形成結晶而堵塞管柱, 所以要先以DI water流洗2xcolumn volume後再放入乙醇, 下次使用前一樣要先用去離子水流洗後再放入PBS buffer做平衡。
方法3. 如只加入PBS封存, 則建議放4-8度冷藏下保存(不可冷凍); 但一定需要注意PBS要經過degas & filtered, 避免下次取出在室溫下時因為溫差而析出小氣泡於管柱內影響使用。
請注意, 實驗過程中所用到的PBS buffer都應經過0.22um filtered & Degas除氣(可使用負壓泵接錐形瓶形成管路的負壓系統抽氣, 或退其次以超音波震盪15分鐘以上), 以避免在column的resin中析出氣泡。

3. 我的細胞上清液原樣體積很大, 該使用何種 qEV Columns 呢?

Ans: 細胞上清液(Cell Culture Media, CCM)需要先進行濃縮體積後再過qEV column來純化提取EVs, 濃縮的倍率可規劃在20x-200x之間; 比如CCM體積如有15-100 mL, 就可以濃縮到500 µL後過qEVoriginal Gen 2 column; CCM體積範圍最大一次可達4-5L, 將其濃縮到100 mL後再過qEV100 Gen 2 column。
CCM體積若是在200 mL以下, 就使用100 kDa離心濃縮管來濃縮; CCM體積若是在200 mL以上, 就使用TFF(切向流過濾, 100 kDa)來濃縮, 相關流程請參閱外泌體實驗知識與流程-如何從細胞上清液提取高純度的胞外體

4. CCM細胞上清液的體積濃縮倍率, 計畫的低倍率或是高倍率有什麼影響?

Ans: 濃縮倍率可規劃在30x-200x之間; 如果濃縮倍率太低, 好處是可以節省離心濃縮的時間和離心濃縮管的使用數量, 但純化提取後得到的EVs粒子濃度會比較少, 以致後續的下游實驗無法得到明顯的結果; 如果濃縮倍率太高, 好處是確保純化提取到的EVs粒子濃度足夠, 但要小心若是濃縮的上清液的"黏度"(vescosity)太高, 代表背景雜蛋白濃度非常高, 會導致qEV管柱的孔隙被過高濃度的雜蛋白粒子堵塞。

5. 經由qEV column後的fractions, 要如何做下游測試例如Western 西方墨點法? 可否每個fraction單獨進行?

Ans: 因為qEV是以SEC原理進行純化, 可區分為EV zone和非EV zone; 流洗出的總體積會比原樣還大, 代表需要經過後製濃縮(使用qEV Concentration Kit)才會得到有把握的分析結果。
qEV column的elution洗脫曲線中所設定的fraction, 是用來設計EV zone為"純度"、"回收率"或"濃度"為考量的微調設定, 不可直接以單獨單一的fraction進行下游WB分析來比較, 而是需要將設計的EV zone先做"合併餾份(pooled fractions)", 再經由qEV Concentration Kit進行濃縮富集EVs成"pellet"後再開始WB分析。