ISOLATING EVs FROM CELL CULTURE MEDIA USING qEV

提取細胞培養上清液內外泌體的要點與建議

細胞培養是在實驗室內模擬細胞過程和開發不同的研究領域的必要模型系統, 包含Extracellular Vesicles(EVs, 胞外體/細胞外囊泡)和其他的相關應用。因此, 從細胞培養基(Cell Culture Medium, CCM)提取細胞所釋放的EVs就存在很多優點, 例如CCM可被人為控制和優化, 並提供了一種可大規模生產CCM-EVs的機會。

EV的字面範圍是泛指由各種活性和凋亡的細胞所製造出的膜性實體, 包含exosomes(外泌體), microvesicles(微泡, 有時會稱為microparticles, 微粒), oncosomes(腫瘤小體)和其他的各種囊泡, 而他們都是由其細胞來源、大小和表面的標記物而被定義的。
這種特性能使他們在細胞間傳遞訊號, 也可以運送某些物質到特定的目標細胞群, 這就更進一步引起了關於診斷和治療開發領域的興趣。

一個穩定、標準化又具可擴充性的以高產率提取CCM中EVs的方法可以顯著的提高其在研究/應用的目的或用途; 通過以管柱為基礎的尺寸排阻色譜法(Size Exclusion Chromatography, SEC), qEV columns可提供一個不影響EVs結構和功能的乾淨樣品, 並可藉由AFC自動提取機(Automatic Fraction Collector)引入自動化流程以大量減少人為錯誤的範圍, 達成上述的目的。

以下流程是我們建議的CCM過程和EVs提取方案

樣本收集

在CCM中的EVs, 其組成和產率取決於多種因素: 例如細胞線、細胞密度、培養液的組成或各種孵化的條件(時間、溫度、氧氣水平等)。

CCM樣品濃度較低, 需要做濃縮 (使用 100 kDa 濃縮管/TFF)

通常EVs在CCM樣品中的濃度不是很高, 一般推薦將CCM樣品進行濃縮以增加接下來qEV提取的回收率, 如果CCM的體積量越大(> 50 mL)時就更需要以此來得到好的EVs產量。
類似超濾的離心濃縮機是普遍使用於< 50 mL的樣品體積, 而> 200 mL的CCM體積會使用cross flow filtration (CFF, 或稱為 tangential flow filtration, 切向流過濾)先進行濃縮。
一般使用於濃縮CCM樣品中的EVs的超濾裝置, 都是基於其濾孔的molecular weight cut-off (MWCO), 大約為100, 300或750 kDa這幾種。

CCM細胞上清液原始體積可從<15 mL - 5 L之間考慮, 經由濃縮30X-200X後通過qEV columns, 詳如下表對照

qEV columns (SEC) 現已有6種類型, 可依照進樣體積不同所選, 而每種類型又都有35 nm和70 nm兩種孔徑可用, 詳細介紹可參閱選單-產品介紹-試劑耗材-qEV columns (SEC)。

唯一需要注意的是, 經過濃縮後的CCM樣品, 進入qEV columns前的蛋白濃度需要< 70 mg/mL, 以避免造成堵塞。