病毒與類病毒於奈米醫學領域的應用
VIRUSES AND VLPS IN NANOMEDICINE
分離與定量的重要性
病毒通常是一種直徑小於300奈米的奈米顆粒, 是由蛋白質亞基組分的衣殼內由某種蛋白質包覆的核酸(DNA或RNA)的相似整體結構組成。依照病毒的生命週期, “衣殼”可能會被宿主細胞衍生的脂質層所包覆, 而感染性的病毒則會非常依附於宿主細胞以能取得能量和進行大分子合成的機器, 最終能自我複製。
在疫苗的相關發展中, 病毒的運用在公共健康領域已是關鍵且為其中一個巨大的成功。因其具備多能性和生物工程表徵, 病毒已具備可用來使許多病毒類疾病和非病毒類傳染病的預防/控制的可能性。
病毒必須經過提取的過程, 才能在感染和發病相關研究時進行病毒載體測量, 包含治療潛力的效用, 而”純化”病毒在生物製程的優化時也是需要的, 包含在疫苗或治療用的病毒/類病毒製劑的生產。
病毒分為兩種:
第一種: 只有蛋白質衣殼的無包膜病毒
第二種: 有脂質層覆蓋衣殼的包膜病毒
無包膜的病毒離開宿主細胞的主要機制是通過裂解宿主細胞膜, 因此, 無包膜的病毒可以藉由培養和人工裂解攜帶病毒的細胞(貼壁或懸浮細胞)在體外進行提取, 接著就從細胞裂解物的上清液中做純化, 優化細胞裂解的方式可保持病毒的完整度, 通常運用裂解液、超聲波和凍融循環過程。
相反的, 包膜病毒可從宿主細胞膜出芽時獲得包膜, 因此, 提取從自然狀態下釋放到細胞外空間的病毒就是最常見的方式, 通常不經由細胞裂解, 而是收集從感染的細胞的上清液。
關鍵的分離方式
Isolation
當顆粒懸浮在複合的細胞衍生流體中, 從非病毒結構/分子中純化病毒會經由某些提取技術, 例如超高速離心(UC)、密度梯度離心(DGC, 或蔗糖超速離心)、共沉澱法和尺寸排阻色譜(SEC)等方式。
然而, UC或DGC這種傳統方式面臨著需要昂貴的一次性設備投入與產能可擴展性的限制; 相反的, SEC方式可提供快速使用、成本可控、省力和可標準化的方式, 因此以已有越來越多的奈米顆粒的研究者採用, 包含病毒領域。
在提取病毒方案關鍵的考量是, 其會與相關的生物顆粒有持續相似之處, 例如胞外體(Extracellular Vesicles, EVs)。EVs和病毒共享了一些生物特徵(例如粒徑、密度), 由包膜病毒和富含細胞來源的細胞衍生膜一起釋放到細胞外的空間, 當要將病毒和EVs分離時, 這通常會導致決定提取方案時的挑戰。
最終, 考慮病毒提取的方案是建立在特定實驗的需求上, 但也很大成分的取決於目標病毒的粒徑和密度以及這些參數與EVs的重疊性; 無包膜病毒(通常為 20-100 nm)通常比包膜病毒(通常為 100-1000 nm)粒徑更小, 舉例來說, 因在血漿或在體外培養的細胞上清液時, EVs的數量濃度遠比病毒高, 因此如何選擇對的方式就是關鍵, 直接導致了病毒顆粒從非病毒顆粒中分離的成功或失敗。
qEV Columns (SEC)
由 IZON Science 開發的 qEV Columns (SEC) 在將病毒從細胞上清液或其他生物流體中提取時, 具備快速、非破壞性和可重複性, 同時也做到了與散裝總蛋白的清晰分離。qEV/35nm與qEV/70nm這兩種孔徑的columns, 代表著其可充分優化35-350 nm 和 70-1000 nm的顆粒提取, 這就包含了絕大多數的病毒粒徑。
原理即是, 小於35 nm或70 nm的顆粒會流經過 qEV columns 的”固向樹酯的孔洞”內而較慢流出, 相反的, 無法進入孔洞的較大的顆粒會較快流出。因此, 較小的類似腸道病毒等(約25 nm), 這樣的顆粒就會從qEV columns的主要餾份(fractions)中快速洗脫的EVs中分離出來, 即會出現在較後面的餾份中。建議是使用前將樣品做一道過濾的步驟, 以提高SEC原理的有效性, 可依照目標病毒的粒徑選擇0.22或0.45 µm的過濾器。
以 Ebola virus(伊波拉病毒)舉例, 其為包含了ssRNA的病毒。平均的看, Ebola virus有1-2 µm 長度, 因此使用0.22 µm的過濾器可從細胞上清液所生的小EVs中提取出大部分的 Ebola virus
Figure 1. Separation of enveloped Ebola virus VLPs from EVs by size with qEV columns (IZON). Positive control VLP marker (VP40, nucleoprotein (NP) and GP) profiles are shown in lane 1, whereas a typical profile of qEV collection volumes of unfiltered (top panel) or filtered through 0.22 m (bottom panel) supernatants from VLP- expressing cells are shown in lane 2-6. Markers for EVs are CD63, CD9, Actin. qEV collection volumes where VLPs are known to elute are indicated by pink box and fractions containing only EVs and no viral particles are indicated by blue box.
再以 Lentivirus (慢病毒) 舉例, 其為包膜病毒(80-100 nm), 粒徑非常接近小EVs。藉由蛋白定量、顆粒計算、反轉錄酶活性測定和慢病毒衣殼免疫印跡等方式, 顯示其中有一個餾份可包含主要和最大豐度的慢病毒顆粒。
Figure 2. Biochemical characterisation of enveloped lentiviral virions purified by qEV columns (IZON). Aliquots from each qEV fraction were analysed by PERT (Product-enhanced reverse transcriptase) assay (pink columns), immunoblot for p24 HIV CA protein (purple columns), total protein (beige columns) and silver staining (blue columns). This shows virus-specific markers (PERT and p24) are most prominent in early fractions (7–10) yet clustered around fraction 8.
與此同時, 需要注意的是以抗體或免疫印跡為原理的分離所進行的純度測定, 比如上述的 Ebola virus, 其衣殼蛋白 VP40 可與EVs相關, 特別是外泌體(Exosome, 小EVs), 其已知VP40蛋白會在外泌體的生物路徑"ESCRT"通路中相互作用, 因此如要從是否有衣殼蛋白的標準來做Ebloa virus的分離時, 就很有可能會造成高產率但低純度的現象(混雜了病毒與EVs)。
關於類病毒
Virus-like Particles (VLPs)
VLPs泛指沒有包含遺傳物質的病毒顆粒。現已存在的VLPs有多種衣殼結構變異, 例如1-4種結構蛋白、1-2層衣殼蛋白、是否有包膜、是否有修飾的衣殼和是否有異源核酸/蛋白質的包裝。眾多的細胞表達系統可被用以製備VLP, 包含細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。VLPs的組裝也可發生在細胞或體外, 比如以透析為主的野生型重組純化衣殼單元或大腸桿菌中產生的無包膜鼠多瘤病毒(MuPyV), 因此, 依照所要達到的製造目的, 從細胞上清液中的VLPs的純度非常高, 能直接繼續做下游的分析。
以SEC原理來提取VLPs可達到75%-95%的顆粒計數或94%的衣殼蛋白免疫印跡, IZON qEV columns (SEC)不需要用到嚴格或需要組合的緩衝液, 不會改變VLPs的本質和其衣殼/抗體的結構。
推薦在使用qEV columns前加上前處理的清洗步驟, 可分離包含團聚細胞、細胞碎屑和其他奈米顆粒的干擾。
病毒與類病毒的定量
在這種情況時, 為了能填補顆粒的絕對量化手段, 對於病毒顆粒的感染性的關聯程度所進行的活性測定就變成強制性的, 比如於流感病毒中, 病毒濃度就與血凝活性測定相關; 針對慢病毒或HIV等逆轉錄病毒的逆轉錄酶活性測定。
可用於疫苗的VLPs製劑在定量分析上就被視為”減活病毒製劑”, 因其需要類似的高劑量病毒顆粒來進行免疫反應。
至今已有許多替代方法以用來定量病毒顆粒濃度, 可能包含經典的斑塊形成測定、以抗體為概念的技術例如ELISA, 生物活性基底的測定、PCR、標示顆粒的流式細胞術等等, 然而這些技術通常僅為實驗性質且耗時, 且常不夠靈敏或兼容更多的下游分析。
在迫切需求單一、快速而又可信賴的方式以進行臨床環境的精簡下, 單顆粒分析方式以Particle-by-Particle測量, 即可評估異質奈米顆粒的關鍵參數分佈, 可如預期的在細胞培養系統中的生產。
符合上述的需求, TRPS (Tunable Resistive Pulse Sensing, 可調式電阻脈衝感應)技術, 使用了病毒/類病毒在通過奈米孔洞(Nanopore)時的”瞬時”電阻增加或脈衝來進行顆粒的定量; 其特徵為可分別以測量脈衝訊號的數量、強度與持續時間, 得到病毒/類病毒顆粒的濃度、粒徑與有效電位(zeta potential), 是一個可進行高輸出測量的單顆粒方式, 不需螢光標記或高技術含量的方案, 突破該領域朝”直接”而非間接測量技術的限制, 而搭配qEV column (SEC)的純化過程又可加速製備時的效率, 可直接以TRPS進行精準定量分析。
Table 1. Summary of total/infectious particle ratio in a VSV (vesicular stomatitis virus) preparation measured by TRPS (qNano, IZON) and plaque assay, respectively. This shows consistency of total particles counts obtained between biological replicates and a low proportion of infectious particles.
事實上, 對於定量小粒徑的病毒/類病毒的方式是個挑戰, 但TRPS方式即可提供真實顆粒粒徑分佈和樣品異質性的準確圖示, 而不像以光學為原理的技術只能提供平均粒徑, TRPS可提供的是單一顆粒測量並精準解析複合模型或多分散性的樣品, 例如從細胞培養液中的衍生物。更多的是, TRPS技術比被視為”gold standard”的電子顯微鏡為原理的定量方式表示了更寬的顆粒濃度範圍。舉例來說, TRPS技術被用來應用於Eblot病毒/類病毒的疫苗應用, 其疫苗製備時已藉由破壞大絲狀的類病毒和凍乾(提高熱穩定性)以進行優化, 可同時保存受測動物體的保護性免疫反應。
Figure 3. TRPS quantification in Virus/VLP preparations. A, Particle size distribution assessed by qNano (IZON) from qEV (IZON) particle-rich fractions (7, 8 and 9) of a STAR-A-HV virus preparation. This shows no clear changes in size distribution from each of the particle-rich fractions. B, Particle size distribution assessed by qNano (IZON) of Ebola virus VLP preparation after sonication and passage through a 0.45 μm (blue) or 0.8/0.2 μm (pink) filter. This shows that double filtration retains smaller particles that are more amenable for manipulation of vaccine formulation.
許多的生物性相關作用都牽涉到其電位(或稱zeta potential), TRPS技術即可測量 Particle-by-Particle 的 zeta potential, 為病毒顆粒/類病毒製劑進行了更全面的表徵分析。在這之中, 奈米顆粒的 zeta potential 可用以判斷病毒/類病毒製備時的顆粒傾向團聚或維持分散狀態。同時, 奈米顆粒的電位也顯示出其是否會影響細胞的攝取效率和受體宿主細胞的毒性作用程度, 可說是相當重要。
Figure 4. Analysis of zeta potential of different virion preparations by TRPS (qNano, IZON). Plot shows virion particle diameter versus zeta potential of three virus preparations: STAR and STAR-A-HV derived particles as well as FHV-1 particles. This shows no difference in zeta potential between two Lentivirus preparations from STAR and STAR-A-HV cells (full ellipsoid), however the Herpesvirus FHV-1 shows a different pattern, shifted to more negatively charged (broken ellipsoid).
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