什麼是 TRPS (Tunable Resistive Pulse Sensing) 可調式電阻脈衝感應?

早在1960年代就提出了RPS電阻脈衝感應的原理, 用以進行細胞計數和測定, 而近年來此項技術則已廣泛用於高通量的DNA測序。

將電解質緩衝液充滿於奈米孔洞的上下端後再施加電壓時, 會產生一個穩定的電流基線(current baseline); 之後粒子在通過奈米孔洞的過程中, 會因為孔洞遮蔽的面積變化而引起電阻脈衝(blockade)訊號, 在一定的氣壓施加下能使每個粒子有序通過孔洞, 此時記錄下每個奈米粒子的電阻脈衝(blockade)訊號就能得到包含: 粒徑、濃度和 zeta potential 膜電位的分析結果。   NP (Nanopore) 奈米孔洞 粒子通過 NP 奈米孔洞時引起的電阻脈衝(Blockades)訊號

Particle-by-Particle 逐個分析每個單獨的奈米粒子(Individual single particle)

粒子通過奈米孔洞(Nanopore)時會引起大小不同的電阻脈衝(Blockades)訊號, 每個訊號都代表一個奈米粒子, 可輕易的辨識出樣本內有三種粒徑分佈(多重粒徑分佈)的奈米粒徑統計圖

在電解質生物性緩衝液中, 奈米孔洞的電阻脈衝(blockade)訊號每秒可測得有 50,000 次; 當施加一個固定的電壓和氣壓後, 奈米粒子會有序地通過奈米孔洞(Nanopore), 每個奈米粒子的電阻脈衝(blockade)訊號都會被記錄下來, 接下來會在同樣的電壓和氣壓下, 紀錄下"奈米粒子標準品"的每個電阻脈衝(blockade)訊號, 由於奈米粒子標準品有已知的粒徑、濃度和表面電位數值, 比對後就可得出樣本中"每個"奈米粒子的粒徑、濃度和 Zeta potential 膜電位數值, 毋庸置疑這是最準確的分析方式。 每個電阻脈衝(blockade)訊號的強度, 代表每個粒子粒徑的大小。 每分鐘電阻脈衝(blockade)訊號的出現頻率, 代表樣本粒子的數量濃度。 電阻脈衝(blockade)訊號的半高寬(FWHM)大小, 代表粒子通過奈米孔洞的滯留時間, 可得知每個粒子的膜電位(界達電位, Zeta potential)。 每次都可藉由"奈米粒子標準品"的已知粒徑、濃度和表面電位(zeta potential)來比對出樣本的奈米粒子結果, 確保分析結果的準確度和重複度。

奈米粒徑(Particle size) + 數量濃度(Number concentration) + 膜電位(Zeta potential)

所偵測到的電阻脈衝會以電流基線的Blockade訊號峰呈現, 可由峰的高度判定奈米粒子粒徑; 峰的出現頻率判定樣本內粒子的數量濃度; 峰的半高寬判定樣本內每個單一奈米粒子的膜電位(zeta potential)。
每個樣品的訊號峰都會馬上同步與NIST認證的奈米粒子標準品(Polystyrene)比對, Sample1-Calibration1, Sample2-Calibration2, Sample3-Calibration3..., 由於NIST奈米粒子標準品的粒徑、濃度等結果都是表定而已知不變的, 所以比對後的樣本結果完全可靠、超高精度且不需要設定任何有關於樣本自身的參數(如: 折射率, 光學焦距等), 以減少分析時的變因。

於電子顯微鏡(SEM)下觀察到的標準粒子

奈米粒子標準品"CPC (Calibration Particle)"瓶裝樣式, 上面標示有平均粒徑、濃度等已知訊息

同步分析多重分佈的奈米粒徑 vs. 數量濃度

生物性樣本的多重粒徑分佈特性為什麼重要?

奈米粒子可從人工合成而來, 此時粒子的粒徑分佈通常會集中成"高斯分佈(常態分佈)", 例如脂質體(liposome)粒子; 然而在自然界中, 所有生物的生成機制都是屬於"複合"性質, 代表的是其體內生物性奈米粒子的"異質性"特徵, 例如外泌體(exosome)粒子; 異質性特徵所呈現的就是多重(種)粒徑分佈現象, 也就是說, 如果要做到真實的生物性學術研究或產品開發品管, 就必須要能得到多重粒徑分佈的分析結果, 而傳統光學分析技術(DLS, NTA)只能得到經由公式換算的常態分佈結果。

最高精度的解析能力

最新的TRPS技術機型" -- Exoid, 能使樣本內的奈米粒子一個接著一個通過奈米孔洞(Nanopore)而收集到每一個數據, 可完全分析具有多重粒徑分佈的生物性樣本, 與下圖電子顯微鏡(SEM)所拍攝的可視圖完全吻合(精確分析出裡面有3種以上的粒徑和濃度分佈)。

TRPS分析樣品的粒徑分佈(三種), 和電子顯微鏡(SEM)的結果完全吻合

電子顯微鏡(SEM)下可觀察到樣品有三種粒徑不同的奈米粒子

同步分析多重分佈的奈米粒徑 v.s 膜電位 (zeta potential)

Zeta potential 膜電位的重要性

Zeta potential是實現膜表面電位分析的指標, 對於相關藥物、病毒、脂質體、外泌體等奈米粒子是非常普遍和重要的, 更多的是在動力學的相關研究中, 能Particle by Particle進行膜電位分析一直是適體(Aptamer)的研究關鍵, 因為適體的膜電位為負電, 可依此觀察到適體與目標粒子的結合情況。
Exoid 使用的 TRPS 技術是利用 zeta potential 和電泳移動率之間的線性關係來測量粒子的電泳率和對流速度並計算出結果, 可精準分辨出不同的奈米粒徑與 zeta potential 關係圖, 以 80 - 400 nm 之間的粒子為主要範圍。

不同粒徑的粒子的 zeta potential 分佈

兩種樣品的 zeta potential 分佈, 每個點都代表一個獨立的奈米粒子

在MISEV外泌體國際規範中, TRPS早已被認證為符合電子顯微鏡(TEM)結果的奈米粒子分析技術
TRPS measurements do however have very high concordance with TEM data. — « MISEV 2023 »

最新的TRPS機型"Exoid"操作畫面

TRPS是唯一可同時滿足以下兩個條件的奈米粒子分析技術: 在所指定的粒徑範圍中, 顯示出單位流體體積的粒子濃度。 得到每個獨立的奈米粒子表面電位數值(Zeta potential)。

Exoid (TRPS) 單顆粒奈米粒徑/數量濃度/Zeta膜電位分析儀的主要應用領域和樣品類型

 

Nanomedicine 奈米醫學 Liposome(脂質體) 生物性片段 -- LNP(Lipid Nano-particle 脂質奈米粒子)、膠束、脂肪、小分子凝集素 (cubosomes)

Extracellular Vesicles 細胞外囊泡 Exosome(外泌體) 細菌 & 細胞 -- 大腸桿菌、浮游生物、希瓦氏菌、桿菌、球菌、酵母菌、疫苗

Vaccine & Virus Formulation 疫苗與病毒製劑 Viruse(病毒) 類病毒顆粒 -- 血液中血小板、粒腺體、外排體、蛋白質鏈結 (protein bioconjugates)、囊泡

Microbubbles 微氣泡 Bubbles(氣泡) 病毒 -- 腺病毒、慢病毒、桿狀病毒、HIV、流感病毒 (H1N1、H7N3)、CMV、登革熱病毒、噬菌體、EV71

 

尿液的Exosome外泌體粒徑分佈圖	腦脊髓液的Exosome外泌體粒徑分佈圖	血清的Exosome外泌體粒徑分佈圖
TRPS技術以2D直方圖顯示特定粒徑範圍的濃度分佈	TRPS技術可進行精準的動力學分析	TRPS技術可符合 3Q & CFR Part11 規範

奈米粒子分析技術的比較: DLS(動態光散射), TRPS(可調式電阻脈衝感應), NTA(奈米粒子追蹤), DCS(沉降離心)

此為人工混合三種不同大小的標準粒子後, 用不同儀器測定出的粒徑分佈圖。四種測定技術中(DLS, TRPS, NTA, DCS), 僅有TRPS技術能提供接近真實的粒徑分佈; 此外, TRPS技術也能測定不同範圍的粒子濃度(e.g. Cmin-Cmax), 這一結果也僅有TRPS技術能夠做到。

非光學系統TRPS取代傳統的光學方式DLS, NTA 溶液中真實的奈米粒徑特徵通常都是非均勻性質且具備多重分佈性質, 一般需要利用粒徑分析來推斷粒子的組成, 如果分析的技術不能提供上述資訊, 那麼分析結果的可信度將大打折扣。 如果某特定技術只能偵測到單一分佈的粒徑大小, 那麼該技術將毫無實際意義, 除非該樣本已知為只含有單一分散的奈米粒子。

 

DLS的結果只能以曲線為代表, 根本無法看出任何粒徑分佈的結果; 而NTA也只能很模糊的”大致”得到3種粒徑分佈。相較之下"TRPS"可完整分析出全部4種粒徑的奈米粒子分佈, 是解析能力最好的技術。

在具有多重粒徑分佈特性的奈米粒子時, NTA技術的解析能力非常有限, 無法精確解析出真實的粒徑結果, 而這對於生物性樣品非常重要, 尤其是外泌體(exosome)的應用中, 使用TPRS技術和TEM(電子顯微鏡)的結果有高度一致性。

根據國際細胞外囊泡學會ISEV旗下權威JEV期刊發表的"測量多重分佈合成模組和細胞外囊泡粒子濃度的正交技術: 誰敢來挑戰?": Robert Vogel et al. “Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques:Who is up to the challenge?”, Journal of Extracellular Vesicles. 2021;10:e12052.- https://doi.org/10.1002/jev2.12052

這個關鍵性的功能性文獻中比較了在Exosome/EVs外泌體領域內6種主流認可之濃度定量分析技術, 包含NTA(奈米粒子追蹤), TRPS(可調式電阻脈衝感應), nFCM(奈米流式細胞), CLS(離心液體沉降), AF4-MALS(不對稱流場流分餾+多重角度光散射), MADLS(多重角度光散射)。

文獻中分別了使用脂質體(Liposome), 外泌體(Exosome/EVs), 奈米粒子標準品(CPN)為樣本進行交叉比對, 得出結論為: 光學系統的AFC-MALS 和 MADLS 無法表達外泌體的數量濃度, NTA的粒徑解析能力非常有限, 不適用於生物性樣品的多重粒徑分佈測量, 非光學系統的TRPS技術是最好的選擇, 不論是在粒徑分析範圍、樣品體積、數量濃度的品質、解析能力、濃度準確度、濃度重複性等幾乎所有指標都是表現最優異的儀器。

Fig 2. 分析3個奈米粒徑混和分佈的樣品, NTA只能分析出2個分佈; TRPS和nFCM都可分析出3個分佈, 但TRPS濃度分析的表現更好。

Fig 3. 分析4個奈米粒徑混和分佈的樣品, NTA只能很粗糙的分析到3個; nFCM雖然可以精確分析出2個分佈, 但200nm以上的粒子卻無法精確分析出差異; TRPS是最優異的分析結果。

Fig 4. 分析4個"低濃度"的奈米粒徑混和分佈的樣品; NTA只能得到非常粗糙的分析結果; nFCM雖然也可以精確分析出2個分佈, 但200nm以上的粒子一樣無法精確分析出差異; TRPS無疑還是最優異的分析結果。

 

細胞外囊泡權威JEV期刊對於外泌體多重粒徑分佈於各種主流粒徑分析技術的解析

Q & A

1. Exoid 需要什麼耗材嗎?

Ans: 實際上, Exoid 使用的 TRPS 技術不含雷射或高解析攝影機等貴重元件, 其使用的是 NP Nanopore、CPC Calibration Particles 和TRPS Reagent Kit三種耗材; NP Nanopore 可反覆拉伸至彈性疲乏(越小的Nanopore需考慮延伸下限維持時間越小), CPC Calibration Particles 是經由 NIST 認證的 Polystryene 顆粒, 每天的實驗只需使用1 μL 稀釋500 or 1000 or 2000倍; TRPS Reagent Kit可提供4個批次的前處理液配置: Wetting solution, Coating solution和Measurement Electrolyte solution, 每批次配置後於4度冷藏保存。

2. Exoid 使用的 TRPS 是一個很直觀的技術而又不需輸入任何有關樣品的參數, 要如何留意樣品條件呢?

Ans: Exoid 的系統和軟體已經是一個半自動的標準化過程, 使用時可以自動調適條件和提示所需的操作步驟; 搭配TRPS Training Kit與原廠線上課程, 將其完成後以建立使用者的經驗和認知, 如用於100 nm以下的樣品分析時因其尺度相當小, 需經過更多的教育訓練和說明實作。

Exoid (TRPS) 單顆粒奈米粒徑/數量濃度/Zeta膜電位分析儀規格

中文名稱: 單顆粒奈米粒徑/數量濃度/Zeta膜電位分析儀 英文名稱: Exoid Nanoparticle Analyzer 分析功能: 粒徑、濃度、界達電位(zeta potential) 分析範圍: 40nm - 11µm 濃度範圍: 1E5 - 1E11 /mL(依粒徑而定) 電解質緩衝液特性 : 生理性溶液 儀器重量: 10.8 kg 儀器底部面積: 30 x 30 cm 儀器高度: 25 cm

Nano-Particle Size Analyzer 奈米粒徑分析儀

為什麼要測量奈米粒子(nano-particle)?

在製藥、醫療、生命科學等領域, 奈米粒子的粒徑大小、濃度甚至zeta-potential(界達電位)都是研發和監控其化學/物理特性的重要表徵, 統稱奈米醫藥(nanomedicines)應用。
奈米醫藥應用代表其可改善治療藥劑的溶解度、釋放曲線和循環週期, 以幫助和引導在體內的局部或精準的藥物傳送, 舉例來說: Doxil是一個大約90奈米的抗癌藥劑-鹽酸多柔比星, 其由PEG化(聚乙二醇化)的脂質體製成, 透過將多柔比星封裝在具有特定粒徑大小和表面特性(PEG化的程度)的脂質體載體中, 這個抗癌藥劑就能有更長的循環週期和有效的治療視窗, 並能透過滲透性的增強和保留作用可被動的標靶腫瘤。

現在有哪些推薦的奈米粒徑分析的技術呢?

根據近期的參考文獻 Vogel et al. Journal of Extracellular Vesicles. 2021;10(3) 內容, 大致有以下幾種方式: Tunable resistive pulse sensing (TRPS) 可調式電阻脈衝感應 Nano flow cytometry (CM) 流式細胞儀 Nanoparticle tracking analysis (NTA) 奈米粒子追蹤分析 Multi-angle dynamic light scattering (MADLS) 多角度動態光散射 Centrifugal liquid sedimentation (CLS) 離心液體沉降

既然知道了奈米粒徑分析的作用和技術, 那麼要如何選擇適合的分析儀器呢?

在比較之前, 請先了解下面的3個問題:

1. 在各種不同粒徑的奈米粒子同時在樣品中時, 這個分析技術能偵測到奈米粒子的亞群體嗎(subpopulations)?

如果只有一種粒徑大小的奈米粒子這只能是基本分析(monodisperse), 在實際的應用中各種不同粒徑的奈米粒子會同時在樣品中, 這就代表了粒徑分析的解析度, 例如奈米塑料(nanoplastics)的粒徑分佈在1奈米~1微米中; 在血漿中的胞外體粒子(extracellular vesicles)的粒徑分佈於30~150奈米中, 所以如何能有多重粒徑的分析解析度是首要的課題。

2. 可偵測到的最小粒徑是多少?

就算擁有可分析多重粒徑的解析度, 如果沒能到達所需要的最小粒徑也是枉然, 舉例來說, 電子顯微鏡(electron microscopy)一般可觀察奈米尺度的世界, 但因為較大粒徑的粒子會遮蔽較小粒徑的粒子, 所以小粒徑的粒子常會被忽略, 以前述的奈米粒徑分析技術來說, 以50奈米為下限是一個重要的分水嶺。

3. 粒徑分析技術對於總粒子濃度的測量準確度是多少?

總粒子濃度對於粒徑分析的應用非常重要, 然而, 有的分析技術使用的群體演算法常會低估其濃度, 造成結果的不準確, 原因在於群體演算法不能精準地把"每個"奈米粒子單獨計算, 最常見的就是NTA以布朗運動進行的演算法所造成的嚴重偏差。