簡介:
無論是在輔助生殖學、病毒學或其他學科上, 內生殖道都是胞外體研究的潛在寶庫, 在這裡我們將討論內生殖道中所含的胞外體之分離純化和應用展望：
監測和了解來自於生殖道的生物液體之組成為何, 不僅對促進人類生殖健康, 而且對保護性的農業的應用領域都是至關重要的, 例如其所帶的生物標誌物可用於微調人類和動物輔助生殖技術(ART)的視窗期, 從而提高ART的成功率。
在鑑定有利於卵母細胞、胚胎或精子的生物液成分的方面也是一樣的, 特別是如果這些成分是ART技術所合適的輔助用劑時; 此外這些生物性液體也可能是疾病診斷和了解生殖道疾病發病機制的關鍵之一。
生物性液體中最通用和最複雜的組成部分之一就是其所帶的胞外體(Extracellular vesicles, EVs), EVs是奈米級的脂雙層囊泡, 包含各種蛋白質、核酸和來自其母細胞的小分子。這使得它們成為具有吸引力的生物標誌物的候選者, 並成為母細胞和靶細胞之間的細胞間通信的有效介質, 我們也將重點討論來源於卵泡液、輸卵管液、子宮液和陰道液的胞外體的分離純化和相關研究。
生殖道液體的組成:
如果你研究的目標是將EVs純化, 那麼了解生殖道液體和血漿之間的一般性差異點將是有用的, 但目前為止所討論的大多數生物液都沒有很詳細的記錄其生化成分, 因此我們只對這些生物液體進行很有限的總蛋白、葡萄糖和鈉含量比較(如下表1)。
人類生殖道液體的成分比較; 數值表示與血漿的樣品相比較時, 每種生物液體的近似倍數變化。改編自[1-8]
總(雜)蛋白量是EVs純化最關鍵的潛在污染物, 是最需要考慮的重要成分。雖然輸卵管、子宮和陰道液體的蛋白質濃度都約為血漿總蛋白質濃度的一半, 但在這些生物液體中的EVs濃度和EVs與蛋白質的比例都還未能完全確定下來。
從生殖道液體中分離EVs的注意事項:
迄今為止的研究尚未對生殖道液體的EVs純化方法進行過廣泛的討論, 因此目前沒有足夠的資料來推薦給陰道液體的EVs標準的純化方法; 然而在2021年的一項研究中有比較了子宮液體[9]的EVs純化方法, 並推論了以SEC(Size Exclusion Chromatography 尺寸排阻色譜法)的qEV column系列(qEVoriginal)是所考慮的選項中表現最好的, 純化後的分離物可提供乾淨的電鏡照片、雜蛋白質污染低、EVs標記物-CD9，TSG101和flotilin-1富集非常良好[9]。
另一項關於卵泡和輸卵管液的EVs的研究也比較了qEV column和密度梯度超離心(DG-UC)的差別, 發現說儘管EVs的粒徑和濃度沒有差異, 但DG-UC純化EVs培養的囊胚品質會優於qEV純化培養的囊胚[10], 然而這項研究並沒有確定EVs或共分離下來的蛋白質是否為導致了這種差異的原因, 這一點尤其重要, 因為SEC法可以很好的分離出功能活躍狀態的EVs粒子, 這使得囊胚品質的差異不太可能是由於EVs所帶的功能而來, 更可能是由分離出的EVs的特定亞群或者DG-UC分離中所得的非EVs結構的污染物造成[11], MISEV指南建議要對”不含EVs的餾分”也進行功能測試, 以確保在EVs的餾分中看到的任何影響都是由於EVs造成的原因, 而不是其他成分引起的[12]。
為了真正衡量出最有效的EVs純化方法, 建議使用EVs粒徑、純度(即低蛋白質污染)和形態做為純化成功的衡量標準。
生殖道EVs的功能生物學和其生物標誌物的展望:
卵泡液
卵泡液是卵泡中所含有的液體, 卵母細胞會在卵泡中成熟, 而在卵泡的發育過程中即是從含有未成熟卵母細胞的小卵泡到含有成熟卵母細胞的大卵泡(見下圖1), 此時從卵泡液中純化得到的EVs的含量會發生變化[13-15], 這與小卵泡所分泌的EVs可促進顆粒細胞(圍繞著卵母細胞產生激素的細胞)增殖的能力增強有關, 這可能表示了EVs在卵泡發育中的作用[14]。
生殖道示意圖, 標記處為目前研究感興趣的可純化得到EVs的位置。
從醫學和農業的角度來看, 卵泡細胞的EVs可用於ART治療, 因為從卵泡液中分離出的卵泡-EVs可促進經冷凍保存後再解凍的卵母細胞減數分裂能力的恢復 [16]。這在保存卵母細胞的應用可能會特別重要, 因為卵母細胞可能必須被低溫保存很長一段時間直到找到適合受精的精子為止。
輸卵管液
輸卵管液是輸卵管內的液體, 卵母細胞通過輸卵管與精子相遇, 受精和早期胚胎發育也在輸卵管內發生。在整個排卵週期中, EVs的含量會發生變化, 例如已報導過的EVs所帶的RNA、蛋白質和小分子[17-18]。這一變化的部分原因是EVs能量底物和參與能量生產的酶的增加, 這些酶可被輸送到胚胎中以幫助其生長[17]。對於ART治療, 包括用於農業、保育和人類生育的ART治療, 輸卵管液-EVs的角色可能會特別重要, 輸卵管液-EVs可以改善體外胚胎的品質和發育[19-22], 甚至可以提高小鼠的出生率[20]。對於精子通過輸卵管到達卵母細胞的過程中, 輸卵管-EVs已被證明可以提高精子的獲能(如受精所需的精子成熟階段)、活力和流動性[23-26], 這表明出在需要模擬生理條件的ART治療中, 輸卵管液-EVs可能特別有效。
子宮液
對子宮液-EVs的研究主要集中在胚胎成熟到著床的過程中, 這一階段涉及到胚胎和子宮內膜之間的雙向交流。從子宮液中純化出的EVs可能參與妊娠的辨識, 在妊娠15-17天的子宮液-EVs中會有胚胎來源的CAPG(妊娠信號辨識[27])。
在體外, 子宮-EVs已被證明能增加囊胚的形成和孵化(即著床的必要步驟)[29]; 相反的, 患子宮內膜炎的牛隻的子宮液-EVs會抑制囊胚發育[30]。
在其他研究中也表明, 子宮液-EVs可能通過涉及干擾素tau的機制而有助於胚胎著床[31-34]。
綜上所述這些研究表明子宮液-EVs對於胚胎發育和著床後期的雙向通信很重要,提示其可能在ART治療中的使用。
陰道液
陰道液-EVs可在陰道沖洗後從液體和粘液組分中的一種或兩種中純化而得, 有趣的是, 這些EVs可能有助於尋找子宮內膜異位症的診斷試驗-這種疾病平均需要7年才能被診斷出來[35]。一項對自發出現子宮內膜異位症的獼猴的早期研究發現, 陰道液-EVs的濃度有顯著的降低[36], 雖然這還不足以用於診斷性測試, 但確實為子宮內膜異位症中陰道-EVs改變的研究帶來了希望, 從而提供了一種可考慮的診斷性測試。
陰道液-EVs也可用于子宮頸癌的診斷, 因為已發現子宮頸癌患者的陰道液-EVs中miR-21和miR-146a這兩種miRNA有增加[37]。在病毒感染中也可看到陰道液-EVs的變化, 特別是EVs-miRNA在子宮頸癌的致病感染、人乳頭瘤病毒(HPV)和主要影響非人靈長類動物的愛滋病毒(HIV)的近親-猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染中發生的改變[38,39]。在SIV及其人類同類HIV中, 陰道液-EVs也被發現具有抗病毒作用, 減少病毒的複製[39,40]。這可能會對由性行為造成的愛滋病病毒感染的預防性治療的發展產生影響, 需要更進一步的研究。
生殖道液體的EVs研究的關鍵問題:
為了促進生殖道液體中的EVs相關研究的發展, 仍有幾個關鍵問題有待解決:
1. 生殖道液的生化成分是什麼?
目前對這些液體的分析研究仍遠遠低於常見的生物樣品, 這一資訊將有助於優化生殖道液體中EVs的純化方式, 特別是在診斷或治療方面; 這對於陰道液尤其重要, 因為陰道液的黏度可能會影響EVs的恢復程度。
2. 生殖道-EVs如何在不同生理位置之間進行比較?
例如子宮-EVs的潛在診斷變化是否可反映在陰道-EVs中？如果是這樣的話就可以減少診斷測試的侵入性。
3. 基於EVs的子宮容受性和妊娠辨識測試在農業上的應用是否可行?
為了對子宮容受性和妊娠辨識進行快速診斷, 很可能需要在同一位置進行很多檢測, 這將需要操作者使用便利而可標準化的商用EVs純化產品和下游的診斷測試以儘量減少人為產生的誤差, 裡如SEC qEV column系列的EVs純化系統, 包括自動提取機(AFC-V2), qEV Concentration Kit, qEV RNA Extraction Kit, 非光學的Exoid(TRPS)奈米粒徑分析儀都將是這種應用研究的理想選擇。
4. EVs是否可以進行除了血液檢驗之外的生殖道疾病檢測?
來自生殖道液體的EVs已顯現出可做為疾病生物標誌物的潛在來源的前景, 但目前尚不清楚這些EVs是否能優於針對相同疾病迴圈中的潛在生物標誌物。
以上的研究表明了生殖道液體-EVs在從醫學到農業和環境保護等各個領域可能具有很大的價值, 這使得該領域的研究不僅可能對人類健康產生革命性影響, 而且對全球農業也具有潛在的極高價值。
參考文獻:
1. Shalgi, R., Soferman, N. & Kraicer, P. F. Gases and electrolytes of human follicular fluid. Journal of Reproduction and Fertility 28, 335-& (1972).
2. Velazquez, A., Reyes, A., Chargoy, J. & Rosado, A. Amino acid and protein concentrations of human follicular fluid. Fertility and Sterility 28, 96-100 (1977).
3. Killian, G. J., Chapman, D. A., Kavanaugh, J. F., Deaver, D. R. & Wiggin, H. B. Changes in phospholipids, cholesterol and protein content of oviduct fluid of cows during the oestrous cycle. J Reprod Fertil 86, 419-426 (1989). https://doi.org:10.1530/jrf.0.0860419
4. Gardner, D. K., Lane, M., Calderon, I. & Leeton, J. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: Metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells. Fertility and Sterility 65, 349-353 (1996). https://doi.org:10.1016/s0015-0282(16)58097-2
5. Lippes, J., Krasner, J., Alfonso, L. A., Dacalos, E. D. & Lucero, R. Human oviductal fluid proteins. Fertil Steril 36, 623-629 (1981). https://doi.org:10.1016/s0015-0282(16)45861-9
6. Kermack, A. J. et al. Amino acid composition of human uterine fluid: association with age, lifestyle and gynaecological pathology. Human Reproduction 30, 917-924 (2015). https://doi.org:10.1093/humrep/dev008
7. Ehrstrom, S., Yu, A. & Rylander, E. Glucose in vaginal secretions before and after oral glucose tolerance testing in women with and without recurrent vulvovaginal candidiasis. Obstetrics and Gynecology 108, 1432-1437 (2006). https://doi.org:10.1097/01.AOG.0000246800.38892.fc
8. Wagner, G. & Levin, R. J. Electrolytes in vaginal fluid during the menstrual cycle of coitally active and inactive women. Journal of Reproduction and Fertility 60, 17-27 (1980).
9. Alminana, C. et al. Isolation and Characterization of Equine Uterine Extracellular Vesicles: A Comparative Methodological Study. International Journal of Molecular Sciences 22 (2021). https://doi.org:10.3390/ijms22020979
10. Asaadi, A. et al. Extracellular Vesicles from Follicular and Ampullary Fluid Isolated by Density Gradient Ultracentrifugation Improve Bovine Embryo Development and Quality. International Journal of Molecular Sciences 22 (2021). https://doi.org:10.3390/ijms22020578
11. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G. & Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine 13, 2061-2065 (2017). https://doi.org:10.1016/j.nano.2017.03.011
12. Théry, C. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles 8, 1535750 (2019). https://doi.org:10.1080/20013078.2018.1535750
13. Navakanitworakul, R. et al. Characterization and Small RNA Content of Extracellular Vesicles in Follicular Fluid of Developing Bovine Antral Follicles. Scientific Reports 6 (2016). https://doi.org:10.1038/srep25486
14. Hung, W. T. et al. Stage-specific follicular extracellular vesicle uptake and regulation of bovine granulosa cell proliferation. Biology of Reproduction 97, 644-655 (2017). https://doi.org:10.1093/biolre/iox106
15. Sohel, M. M. H. et al. Exosomal and Non-Exosomal Transport of Extra-Cellular microRNAs in Follicular Fluid: Implications for Bovine Oocyte Developmental Competence. Plos One 8, 16 (2013). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0078505
16. Ferraz, M. et al. Follicular extracellular vesicles enhance meiotic resumption of domestic cat vitrified oocytes. Scientific Reports 10 (2020). https://doi.org:10.1038/s41598-020-65497-w
17. Gatien, J. et al. Metabolomic Profile of Oviductal Extracellular Vesicles across the Estrous Cycle in Cattle. International Journal of Molecular Sciences 20 (2019). https://doi.org:10.3390/ijms20246339
18. Alminana, C. et al. Deciphering the oviductal extracellular vesicles content across the estrous cycle: implications for the gametes-oviduct interactions and the environment of the potential embryo. Bmc Genomics 19 (2018). https://doi.org:10.1186/s12864-018-4982-5
19. Lopera-Vasquez, R. et al. Extracellular Vesicles from BOEC in In Vitro Embryo Development and Quality. Plos One 11 (2016). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0148083
20. Qu, P. X. et al. Extracellular vesicles derived from donor oviduct fluid improved birth rates after embryo transfer in mice. Reproduction Fertility and Development 31, 324-332 (2019). https://doi.org:10.1071/rd18203
21. Qu, P. X. et al. Extracellular vesicles and melatonin benefit embryonic develop by regulating reactive oxygen species and 5-methylcytosine. Journal of Pineal Research 68 (2020). https://doi.org:10.1111/jpi.12635
22. Alminana, C. et al. Oviduct extracellular vesicles protein content and their role during oviduct-embryo cross-talk. Reproduction 154, 253-268 (2017). https://doi.org:10.1530/rep-17-0054
23. Franchi, A., Moreno-Irusta, A., Dominguez, E. M., Adre, A. J. & Giojalas, L. C. Extracellular vesicles from oviductal isthmus and ampulla stimulate the induced acrosome reaction and signaling events associated with capacitation in bovine spermatozoa. Journal of Cellular Biochemistry 121, 2877-2888 (2020). https://doi.org:10.1002/jcb.29522
24. Ferraz, M., Nagashima, J. B., Noonan, M. J., Crosier, A. E. & Songsasen, N. Oviductal Extracellular Vesicles Improve Post-Thaw Sperm Function in Red Wolves and Cheetahs. International Journal of Molecular Sciences 21 (2020). https://doi.org:10.3390/ijms21103733
25. Ferraz, M., Carothers, A., Dahal, R., Noonan, M. J. & Songsasen, N. Oviductal extracellular vesicles interact with the spermatozoon's head and mid-piece and improves its motility and fertilizing ability in the domestic cat. Scientific Reports 9 (2019). https://doi.org:10.1038/s41598-019-45857-x
26. Alcantara-Neto, A. S. et al. Porcine oviductal extracellular vesicles interact with gametes and regulate sperm motility and survival. Theriogenology 155, 240-255 (2020). https://doi.org:10.1016/j.theriogenology.2020.05.043
27. Tinning, H. et al. The role of CAPG in molecular communication between the embryo and the uterine endometrium: Is its function conserved in species with different implantation strategies? Faseb Journal 34, 11015-11029 (2020). https://doi.org:10.1096/fj.202000882RR
28. Nakamura, K. et al. Induction of IFNT-Stimulated Genes by Conceptus-Derived Exosomes during the Attachment Period. Plos One 11 (2016). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0158278
29. Qiao, F. et al. Bovine uterus-derived exosomes improve developmental competence of somatic cell nuclear transfer embryos. Theriogenology 114, 199-205 (2018). https://doi.org:10.1016/j.theriogenology.2018.03.027
30. Wang, X. G. et al. Exosome-derived uterine microRNAs isolated from cows with endometritis impede blastocyst development. Reproductive Biology 19, 204-209 (2019). https://doi.org:10.1016/j.repbio.2019.06.003
31. Kusama, K. et al. Intrauterine exosomes are required for bovine conceptus implantation. Biochemical and Biophysical Research Communications 495, 1370-1375 (2018). https://doi.org:10.1016/j.bbrc.2017.11.176
32. Ruiz-Gonzalez, I. et al. Exosomes, endogenous retroviruses and toll-like receptors: pregnancy recognition in ewes. Reproduction 149, 281-291 (2015). https://doi.org:10.1530/rep-14-0538
33. Hua, R. W. et al. Small RNA-seq analysis of extracellular vesicles from porcine uterine flushing fluids during peri-implantation. Gene 766 (2021). https://doi.org:10.1016/j.gene.2020.145117
34. Giacomini, E. et al. Global transcriptomic changes occur in uterine fluid-derived extracellular vesicles during the endometrial window for embryo implantation. Human Reproduction 36, 2249-2274 (2021). https://doi.org:10.1093/humrep/deab123
35. Arruda, M. S., Petta, C. A., Abrao, M. S. & Benetti-Pinto, C. L. Time elapsed from onset of symptoms to diagnosis of endometriosis in a cohort study of Brazilian women. Human Reproduction 18, 756-759 (2003). https://doi.org:10.1093/humrep/deg136
36. Muth, D. C. et al. Potential role of cervicovaginal extracellular particles in diagnosis of endometriosis. Bmc Veterinary Research 11 (2015). https://doi.org:10.1186/s12917-015-0513-7
37. Liu, J. et al. Increased Exosomal MicroRNA-21 and MicroRNA-146a Levels in the Cervicovaginal Lavage Specimens of Patients with Cervical Cancer. International Journal of Molecular Sciences 15, 758-773 (2014). https://doi.org:10.3390/ijms15010758
38. Wu, Y. et al. Changes of miRNA Expression Profiles from Cervical-Vaginal Fluid-Derived Exosomes in Response to HPV16 Infection. Biomed Research International 2020 (2020). https://doi.org:10.1155/2020/7046894
39. Zhao, Z. Z. et al. miRNA profiling of primate cervicovaginal lavage and extracellular vesicles reveals miR-186-5p as a potential antiretroviral factor in macrophages. Febs Open Bio 10, 2021-2039 (2020). https://doi.org:10.1002/2211-5463.12952
40. Smith, J. A. & Daniel, R. Human vaginal fluid contains exosomes that have an inhibitory effect on an early step of the HIV-1 life cycle. Aids 30, 2611-2616 (2016). https://doi.org:10.1097/qad.0000000000001236
