[內容發表] 隱藏在病毒生產中的角色: 利用 TRPS 檢測缺陷干擾顆粒 (DIPs) 的分析報告

隱藏在病毒生產中的角色: 利用 TRPS 檢測缺陷干擾顆粒 (DIPs) 的分析報告

來源: IZON Science

什麼是缺陷干擾顆粒(DIPs)?

在探討病毒變異時人們通常會想到流感或 COVID-19 的新冠病毒株, 但這些只是冰山一角。許多病毒具有很高的複製錯誤率, 會產生具有多種基因組突變和結構改變的異質群體。其中一個特定的病毒顆粒亞型就是缺陷干擾顆粒(DIPs)。
DIPs 是由包裝在正常病毒顆粒中的缺陷病毒基因組(Defective Viral Genome, DVG)所組成的病毒顆粒。這些缺陷病毒基因組是由於複製錯誤(如刪除、重排或突變病毒的遺傳物質)而自發產生的。

特性	內容
結構	外觀與野生型 (wild-type) 病毒顆粒相同, 但內部基因組長度不同。
複製能力	由於遺傳改變, DVG 無法自行複製。
共感染依賴性	如果 DVG 保留了啟動複製和允許包裝的信號, 在與提供缺失了蛋白質與功能的野生型病毒共感染的細胞中, DVG就可以被複製並組裝成病毒顆粒。
干擾機制	某些 DVG 的複製速度比野生型病毒基因組還快, 會與其競爭病毒複製和衣殼化的機制, 其產量甚至超過野生型病毒顆粒, 這種對野生型病毒複製的干擾正是 DIPs 名稱的由來。

為什麼我們需要關注 DIPs？

DIPs 代表著是挑戰還是機遇, 取決於其具體的情境。
一方面, 它們抑制病毒複製的能力使其具有做為抗病毒治療劑的潛力。另一方面這種特性也可能是一個缺點, 因為它們可能會阻礙疫苗等應用病毒的大規模生產。

DIPs 的發現歷史

DIPs 的出現最早是由 Preben von Magnus 在 1940 年代後期所報導(當時並未被稱為 DIPs）。Von Magnus 發現, 在用流感病毒連續接種雞蛋期間會出現缺陷病毒顆粒。隨後幾十年的研究發現幾乎所有病毒科在自然感染和體外(in vitro)培養中都存在「von Magnus 現象」。
DIPs 的生長動態被證明其依賴於感染複數(Multiplicity of Infection, MoI)：

更高的劑量會導致干擾更早出現。
隨後會出現野生型和 DIP 病毒群體的週期性擴張和減少。
最終會破壞病毒生產並導致產量降低。

以上的發現確立了 DIPs 在建立體外病毒生產系統時是一個重要的考量因素。

DIPs 在疫苗製造與治療應用中的挑戰

疫苗製造的挑戰

DIP 效應對疫苗製造構成了重大挑戰。傳統的流感疫苗是從在雞蛋中生長的病毒所生產, 但每年要接種和取得數百萬個雞蛋都非常費力。
轉向基於細胞培養的疫苗生產可以在實用性、可擴展性和生產速度方面提供優勢, 這些特徵在面對未來的流行病時都是有益的。連續病毒培養(Continuous viral culture)被認為是一種特別理想的方法, 因為它可以最大限度地利用生產設備並優化成本效益。
然而在最初嘗試連續培養生產流感病毒時, 其特徵會由於 DIPs 而導致了病毒滴度的振盪。儘管已經嘗試透過某些方法來優化來克服這個問題, 但基於細胞培養的疫苗製造在很大程度上仍然依賴於批次生產(batch production), 而基於雞蛋的製造仍繼續主導著流感疫苗的生產。

治療應用的障礙

DIPs 不僅會對疫苗的生產有負面影響, 還會有以下情況:

生物殺蟲劑: 開發桿狀病毒(baculoviruses)做為生物殺蟲劑的努力一直受到 DIPs 的阻礙, 因此需要努力修改病毒基因組並抑制 DVG 的形成。
重組蛋白與基因治療: 桿狀病毒會廣泛用於重組蛋白生產並且越來越引起人們對類病毒顆粒(virus-like particle)的疫苗生產和基因治療的興趣。DIPs 也會阻礙這些應用, 有可能影響產品的數量和品質。

因此，需要制定相應的策略來管理和減少這些影響, 從而優化開發的進程。

使用可調式電阻脈衝感應 (TRPS) 進行病毒顆粒分析

儘管 DIPs 無處不在且對製造過程有潛在影響，但 DIP 檢測仍然存在挑戰。

傳統檢測方法的局限性

檢測技術	局限性
基於顆粒特徵的技術 (如大小、密度或形態)	DIPs 通常與野生型病毒無法區分。
基於 PCR 的方法	DIPs 中存在的結構和序列變化的多樣性意味著 PCR 方法可能會遺漏某些亞群。
次世代定序 (NGS)	雖然可以做到真正無偏差的 DVG 檢測，但它往往比定量 PCR 方法更昂貴且分析更複雜。
空斑分析 (Plaque assays)	測量的是感染性顆粒因此無法直接檢測 DIPs。雖然在高病毒濃度下沒有空斑而低濃度下有空斑這可以定性地表明存在被滴定掉的 DIP 干擾。

TRPS 技術的應用

由於直接與定量檢測 DIPs 存在困難性因此需要結合多種技術來首先計算出病毒顆粒的總數, 其次再計算出具有感染性的比例。
可調式電阻脈衝感應 (Tunable Resistive Pulse Sensing, TRPS) 是一種歷史悠久的計算病毒顆粒數量的方法。
最近, TRPS被與空斑分析一起使用以檢查使用攪拌槽生物反應器 (stirred-tank bioreactors) 的 SARS-CoV-2 疫苗生產系統中的 DIP 程度。

病毒顆粒的總數由 TRPS 確定
空斑分析用於計算感染性顆粒的數量

透過這種方式可以比較出不同製造方法中感染性與非感染性顆粒的比例。研究證明, 基於孔板的方法 (plate-based method) 和攪拌槽生物反應器方法之間的 DIP 程度並沒有顯著的差異。

結論

缺陷干擾顆粒 (DIPs) 在病毒生產中扮演著「隱藏角色」, 它們既是潛在的抗病毒治療手段也是疫苗和基因治療載體大規模生產的重大障礙。由於 DIPs 在物理特性上與野生型病毒極為相似使得傳統的檢測方法面臨了諸多挑戰。結合使用 TRPS(量化總顆粒數)與空斑分析(量化感染性顆粒數)，可提供一種非常有效的評估生產過程中 DIP 程度的方式, 這對於優化細胞培養疫苗生產和確保產品品質都至關重要。

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