日本PMDA(Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，醫藥品醫療機器總合機構)是日本的藥品與醫療器械監管機構, 成立於2004年4月1日，是一個獨立的行政法人機構。其核心使命是通過確保藥品和醫療器械的安全性、有效性和質量來保護公眾健康, 與日本厚生勞動省為共同合作運作。
2024年8月, PMDA官方的Science Board發佈了近40頁的白皮書, 近似於一步步的拆解外泌體Exosome/細胞外囊泡EVs的治療產品從細胞庫、GMP流程、品管實施、非臨床(研究級)到FIH的全部細節, 諾曼達科技為您解析如下:

日本PMDA《基於細胞外囊泡的治療產品之品質與安全性考量》指南深度解讀

發布單位： 日本醫藥品醫療機器總合機構 (PMDA) 科學委員會
發布日期： 2024年8月7日
文件來源： Quality and Safety Considerations for Therapeutic Products Based on Extracellular Vesicles

1. 指南概述

本指南由日本PMDA的科學委員會發布，旨在全面評估基於細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)的治療產品在開發、製造、品質控制及安全性評估方面所面臨的挑戰與考量。EVs作為體內天然的分子傳遞系統，因其靶向能力、生物相容性及低免疫原性等優點，在藥物開發和藥物遞送系統(DDS)領域展現出巨大潛力。然而，其臨床應用仍面臨諸多挑戰。本指南匯總了日本專家的最新研究討論，為EVs的臨床應用提供了科學和監管層面的指導，期望能促進新型EV療法的發展。

2. 核心概念與分類

指南首先對EVs進行了定義和分類，強調了其作為細胞間通訊工具的重要性。

EVs是由細胞釋放、具有脂質雙層膜的囊泡，其內部包裹著蛋白質、核酸(如mRNA、miRNA)等功能性分子。它們通過體液運輸，將這些分子遞送至靶細胞，從而改變接收細胞的表型和基因表達。

根據國際細胞外囊泡學會(ISEV)的建議，指南將EVs分為兩大類：

• 天然EVs (Native EVs): 來自未經基因改造或經過基因改造但無轉基因產物的細胞。這類EVs利用其內源性物質發揮治療作用，例如，來自間質幹細胞(MSC)的EVs具有抗炎和組織修復的潛力。

• 工程化EVs (Engineered EVs): 通過基因工程改造生產細胞，或在EVs純化後對其表面進行修飾、裝載特定藥物(如siRNA、小分子藥物)而製成。這類EVs主要作為藥物遞送系統(DDS），旨在提高藥物的靶向性和穩定性。

3. 品質與製造考量 (CMC)

指南的核心部分詳細闡述了EVs產品在製造與品質控制方面的關鍵考量，強調了標準化和一致性的重要性。

3.1. 起始材料：細胞來源的選擇

EVs的特性高度依賴於其來源細胞。

3.2. 細胞庫的建立與鑑定

為了確保生產的一致性，指南強調必須建立主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)。

3.3. EVs的表徵與分析

由於EVs的高度異質性，單一的分析方法不足以全面評估其品質。

3.4 EVs的製造方式

3-4-1. 細胞來源選擇與細胞庫建立(Cell source & Cell Bank)

細胞是 EVs 品質的根源，而EVs 的 cargo、活性成分以及功能特性會高度依賴細胞的狀態、來源及純度, 因此 PMDA 指南強調必須：

• 建立 MCB/WCB 或 DCB(視自體/異體/細胞系而定）
• 確認細胞身分(identity）、表面標誌、基因穩定性
• 針對 immortalized 或 genetically modified cell lines 做基因載體(vector)序列確認與複本數測定

3-4-2. 製造培養條件(Culture Conditions)

PMDA 指南指出EVs分泌與 EVs 的組成會受到多種因素影響，如：

• 培養基組成(FBS、hPL、細胞激素等)
• 細胞密度
• 氧氣、CO₂、溫度條件
• 細胞凋亡比例(apoptotic EVs 具有完全不同的生物功能)

FBS 與 hPL 的重點：

• FBS 不建議用於 GMP(除非有特殊用途), 因為這會有引入 bovine EVs、病毒/內毒素的風險
• hPL 為人源替代品，但仍需驗證感染風險與殘留量

3-4-3. 細胞狀態與製程一致性(In-process controls)

正式純化前必須確認：

• 接種後細胞狀態：型態、活率、凋亡比例
• 培養上清中的 EVs 數量是否符合預期
• EVs 內部預期的活性成分是否達標

這些是確保後續純化的 EVs 批次一致性的重要步驟。

3.5 EVs的純化方法(EV Purification Methods)

PMDA 明確指出目前無「黃金標準」，須視產品性質組合多種方法。

純化的瓶頸與原則

• EVs 與病毒(特別是 enveloped virus)大小相近 → 不易分開
• EVs 與蛋白複合體、脂蛋白、聚合物也常共沈或共流出

不同大小的 EVs(sEV、m/lEV)有不同活性，需視目標選擇方法

PMDA 指南解析主流的純化方法和建議:

[1]. 超高速離心(Ultracentrifugation, UC)

常見於研究階段，但：

• 難以放大量
• 容易 co-isolate free proteins
• 無法作為商業化製程

通常 UC 只適合作為初步濃縮，並需要搭配其他的方法。

[2]. PEG 或其他聚合物沉澱(Precipitation by PEG 等)

缺點明確：

• 大量蛋白聚集物與雜質
• 需建立殘留測定方法（因 PEG 可能留在製劑中）

[3]. 親和色譜(Affinity Chromatography)

可依 EV 表面蛋白進行純化，例如：

• CD9/CD63/CD81 抗體
• 或針對 engineered EV 上的特定蛋白⁽如 GE11, RVG peptide⁾

但需注意：

• EV markers ≠ 所有 EV 都有
• 得確認「被純化到的子群」是否仍具活性

[4]. 粒徑為基礎的方式(Size-based methods)

• SEC (Size Exclusion Chromatography)
• Ultrafiltration (MWCO membranes)

優點：可 scale-up大體積進行，產物有均一性
缺點：可能混入有蛋白聚集體、脂蛋白或與 EV 相近大小的物質，需要進行殘留測定

[5]. 離子交換色譜(Ion-exchange chromatography)

利用 EV 表面電荷分離（如 anion exchange）

• 可達較高純度
• 已有研究成功 scale-up大體積生產

[6]. 多方法整合(Combination methods)

PMDA 強調需要的流程為：

濃縮(Concentration)→ 初濾去除雜質 → 粒徑/電荷/親和色譜的組合

此可達到商業化與 GMP 等級的一致性。

3.5 EVs 特異性的品質表徵方式(EV-specific Quality Characterization)

是這份指南中最重要的核心內容之一

3-5-1. 為何 EVs的QC 很困難？

• EVs 是有 高度異質性(heterogeneous)的粒子族群
• 不可能像蛋白藥(monoclonal antibody)那樣去定義單一分子
• 每顆 EVs 的 cargo 都可能不同
• EVs 與 lipoprotein、virus、protein complex 大小重疊

因此 QC 需以多種正交方法(orthogonal)來驗證。

3-5-2. EVs 組成分析(Composition analysis)

需要分析的成分有：

• 蛋白質(Western blot, ELISA, Mass spec)
• 脂質
• RNA(miRNA, mRNA)
• 醣鏈(glycan)
• 表面 tetraspanins(CD9、CD63、CD81)
• 內涵物(TSG101、Alix)

注意事項: MISEV 建議至少 3 個 EV markers，但 PMDA 認為不必完全遵照研究領域標準而是需依產品特性決定。

3-5-3. 物理化學特性（Physicochemical properties）

[1]. 粒徑分析(Size distribution)

建議使用 單顆粒分析方法(single particle analysis)：

• NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)
• TRPS (Tunable resistive pulse sensing)
• FCS (Fluorescence correlation spectroscopy)
• EM (TEM/SEM)
• AFM (Atomic force microscopy)

注意：不推薦用DLS, 因為 EVs 屬於是 polydisperse這會導致DLS 容易失真。

[2]. 粒子數(Particle count)

主要使用：

• NTA
• TRPS

[3]. 表面電位(Zeta potential)

• ELS (Electrophoretic light scattering), 但PMDA 也提到新的「單顆粒 zeta potential」技術正在發展中。

3-5-4. 生物活性(Biological Activity / Potency Assay)

這是最關鍵的 QC 要求。

Potency assay 用於：

• 「證明」EV 具預期的生物機制（MoA）
• 「量化」批次間活性
• 作為臨床給藥單位（dose unit）基準（如：per particle, per µg protein）

常見 potency assays：

• miRNA/protein 功能測試
• 抗發炎作用(IL-1β/ TNF-α 抑制)
• 免疫調節(T cell suppression、NK activation)
• 血管新生(endothelial tube formation)
• 纖維化抑制
• 細胞遷移/修復

PMDA 特別強調：EVs 的作用機制通常無法完全明確，因此必須使用多個 orthogonal potency assay

3-5-5. EVs 製劑中的雜質(Impurities)— 特別重要

PMDA 將 EV 雜質分為：

• 非預期 EVs（未含活性成分）
• 製造過程產生的 altered EVs / degraded EVs
• 來自細胞本身：mitochondria、Golgi vesicles
• 來自培養液：FBS / hPL EVs, serum protein complex
• 感染源：virus / mycoplasma
• 實驗器材的微粒（plastic debris）

因此 QC 必須包含「雜質的定性與定量」。

4. 非臨床與臨床安全性的考量

指南對EVs產品的安全性評估提出了系統性要求。

非臨床研究：

• 藥物動力學 (PK)：由於EVs的異質性，傳統PK研究難以進行。指南建議使用上述標記方法追蹤EVs在體內的分佈、吸收和清除。
• 毒理學研究：需評估EVs的靶向毒性(On-target toxicity)和脫靶毒性(Off-target toxicity)。特別是對於工程化EVs，需同時評估EV載體本身和其裝載藥物的毒性。
• 免疫原性：需評估EVs引發的不良免疫反應，特別是來自非人源細胞(如植物、牛乳)的EVs。

臨床研究：

• 首次人體試驗 (FIH)：起始劑量的確定是一個挑戰。指南建議基於非臨床研究的毒理數據(如NOAEL)和效價測定結果，謹慎設計起始劑量。

免疫原性風險：在臨床試驗中需密切監測免疫反應，特別是重複給藥時可能產生的抗體。

5. 圖表解讀

 

Figure 1: EVs 治療產品開發的路線圖(Roadmap)

此圖其實是一個宏觀的開發框架圖，在 PMDA 指南中指出「開發 EV 藥物一定要做哪些事」的流程。

內容分為 五大區段：

1. 製程方法開發(Manufacturing Method Development)

製程建立、細胞來源選擇、培養條件、純化方法、製程一致性等內容

核心工作內容

• 選擇並建立 EVs 製造用細胞(Primary cells、MSC、iPS/ES-derived cells、immortalized lines)
• 建立 細胞庫(Cell Bank：MCB/WCB/DCB)
• 建立標準化的培養流程
• 控制培養環境避免污染(病毒、細菌、內毒素等)
• 選擇並建立合適的 EVs 純化技術 (例如 SEC、ion-exchange、ultrafiltration、affinity、組合式流程)

合作夥伴

• 細胞治療專家
• 生產工廠(GMP manufacturing)
• 生物加工工程師(bioprocess engineers

2. 品質表徵分析(Quality Characterization)

核心工作內容

確立 EVs 的 關鍵品質屬性(CQAs)

• 組成：蛋白、RNA、脂質、糖鏈
• EVs markers：CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix…
• 粒徑分布、粒子數量、Zeta potential界達電位
• 生物功能(potency assay)
• 建立一致的測定方法(如NTA、DLS、TRPS、Western、Mass spec…)

合作夥伴

• 分析化學家
• EVs 研究學者
• 品質管制(QC)單位

3. 非臨床研究(Nonclinical Studies)

核心工作內容

生物分佈(biodistribution/PK)

• EVs 標定(PKH, DiR, RI, USPIO…)
• 評估器官分布、滯留時間、清除途徑

藥效(Pharmacology)

• 使用細胞、動物模型確認治療機制與作用

毒理(Toxicology)

• 重複給藥毒性
• 安全性指標
• 外來物污染評估(virus, mycoplasma)

合作夥伴

• 動物實驗研究人員
• 藥理毒理專家
• 成像與 EVs 標定技術專家

4. 臨床開發(Clinical Trials)

核心工作內容

• FIH(First-in-Human)劑量設定(基於 MABEL 或 NOAEL)
• 安全性監測
• 與製造批次一致性比對
• 評估臨床療效
• 長期追蹤 EVs 生成細胞的安全性(若為 engineered EVs)

合作夥伴

• 臨床醫師
• 統計與臨床研究團隊
• 法規專家(Regulatory Affairs)

5. 整體的跨領域合作網絡(Collaborative Partners)

Figure 1 強調了整個開發流程的高度跨領域性，包括：

• 細胞／幹細胞研究者
• EVs 生物學家
• 製程工程師
• 分析與品控(QC/QA)
• 動物實驗與成像專家
• 臨床研究者
• 法規人員(PMDA/FDA/etc.)

核心訊息總結:

1. EVs 產品開發不是單一步驟，而是一條完整管線：細胞建立 → 製程開發 → EVs 純化 → 品質確認 → 非臨床 → 臨床。
2. 每一階段都必須建立明確的標準化流程(SOP/GMP)
3. 品質特性(CQAs)與 potency assay 是最核心的開發難點
4. 病毒安全(Viral safety)是 EV 特有且重大的風險點
5. 整個流程高度依賴跨領域整合與合作

Figure 2: EVs標記方法的可操作性與靈敏度

此圖為研究人員在進行EVs體內分佈(生物分佈)研究時，選擇標記方法提供了清晰的決策依據。圖表將不同的標記技術根據「操作難易度」和「偵測靈敏度」進行了分類。

• 左下象限 (操作簡單，靈敏度低)：如CFSE等染料，適合初步或定性的示蹤研究。
• 右下象限 (操作簡單，靈敏度較高)：如兩親性染料 (PKH, DiI) 和 磁性粒子 (USPIO)，在操作便利性和偵測效果之間取得了較好的平衡，是目前應用較廣泛的方法。
• 右上象限 (操作困難，靈敏度高)：如放射性同位素標記 (¹²⁵I) 和 融合蛋白技術 (CD63-GFP)，雖然操作複雜、成本高，但能提供最精確的定量數據，適用於後期的藥物動力學研究。

Table 1 討論了幾種主要細胞來源的優缺點：

細胞來源	優點	缺點與風險
自體/同種異體初代細胞	- 安全性高- 更接近天然生理狀態	- 難以標準化- 產量有限- 批次間差異大
iPS/ES細胞衍生細胞	- 可大規模生產- 可建立標準化細胞庫	- 存在致瘤性風險- 表型不穩定
永生化細胞株	- 可大規模、標準化生產- 技術成熟	- 存在致癌基因污染的理論風險- 長期培養下表型可能不穩定

Table 2 詳細列出了對各級細胞庫進行鑑定的要求，總結如下：

測試項目	供體細胞庫 (DCB)	主細胞庫 (MCB)	工作細胞庫 (WCB)	體外培養極限細胞 (LIVCA)
表徵鑑定	✓	✓	✓	✓
純度測試	✓	✓	✓	✓
無菌測試	✓	✓	✓	✓
支原體測試	✓	✓	✓	✓
病毒測試	✓	✓	✓	✓
儲存穩定性	✓	✓	(適用時)	-
基因表現構建體分析	(適用時)	(適用時)	(適用時)	(適用時)

註：LIVCA(Limit of In Vitro Cell Age)指用於生產的細胞達到其體外培養壽命極限的狀態，對其測試是為了確保整個生產週期內的穩定性。

Table 3 總結了用於EVs表徵的多種分析方法，涵蓋了生物物理、生物化學及功能性分析。

分析類別	具體項目	常用技術方法
生物物理特性	粒徑分佈、濃度、型態、Zeta電位	NTA, TRPS, DLS, 電子顯微鏡 (TEM, SEM), AFM
生物化學特性	總蛋白、總核酸、總脂質、EV標記物 (CD9, CD63, CD81)、非EV標記物、活性成分	BCA/Bradford Assay, RiboGreen Assay, 質譜, 西方墨點法, 流式細胞術, ELISA
生物學活性	效價測定 (Potency Assay)	細胞活性測試 (增殖、遷移、凋亡), 基因/蛋白表達分析, 體內動物模型

 6. 結論

日本PMDA的這份指南為全球EVs治療產品的開發者提供了寶貴的參考框架。它不僅系統性地梳理了從生產製造到臨床應用的全鏈路考量，還重點強調了當前技術的局限性和未來需要努力的方向。核心觀點可以總結為：

1. 標準化是關鍵：無論是細胞來源、生產工藝還是品質檢測，都必須建立嚴格的標準化流程，以確保產品的一致性和可比性。
2. 全面性的表徵：必須採用多種互補的分析方法，從物理、化學和生物學多個維度對EVs進行全面表徵。
3. 風險控制：應基於科學和風險評估的原則，對潛在的安全性風險(如致瘤性、免疫原性)進行充分識別和控制。

總體而言，本指南的發布標誌著EVs治療正從基礎研究向規範化的藥物開發邁進，為該領域的健康發展奠定了重要的監管科學基礎。
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