如何從血液樣本内提取高純度的外泌體

Extracellular vesicles(EV, 胞外體/細胞外囊泡)是由多種活化和凋亡的細胞類型所製造的外膜衍生物的廣泛分類。"EV"的內容包含Exosome(外泌體), Microvesicles微泡(有時稱為"microparticles"微粒子), Oncosomes(腫瘤小泡)和其他的囊泡, 主要是由其細胞的起源、大小和表面生物標記物所分類, 都可用於在細胞間轉移訊號與轉移分子到特定細胞分佈的能力, 這使得EV成為一個具有吸引力的工具用於診斷和治療應用的潛力。

雖然由血液衍生的EVs具有高度複合度和異質性的分佈, 在包含許多從多種的細胞起源的EV類型中, 血液衍生的EVs是一個有著高度價值來源的生物標記物的研究目標, 裡面有多種條件/疾病可在循環的EVs上有明顯的成分影響。
儘管如此, 血液的前分析階段對於EVs的提取卻是個重要的變數來源, 這是因為有大量的事實表明, 血液細胞(尤其是血小板), 會在樣品的收集和處理過程中可被輕易的活化並釋放EVs。血小板在一般的血液處理流程中可被多種的分子與條件下所活化, 那麼如何收集樣品和處理工具的使用就變得非常重要, 以避免活化血小板或是在儲存和分析前移除血小板。

本篇流程將帶您了解如何考量實驗流程與使用qEV column(SEC)從血液中提取EVs的要點。

考量與建議
檢測和表徵由血液衍生的EV的分佈時經常會在收集血液樣品和提取EV時被"人為的因素"所困擾; 收集的過程通常會改變生物樣品內的分子完整性、功能或/和組成分, 所以在選擇樣品的介質時(全血、血漿或血清)就需要有特殊的考量, 其也包含在評估所使用的血液收集與處理的方法上, 相關內容請參閱下列圖1的流程。

EV 來源

在設計EV分析的研究中, EV的來源是一個重要的考量點, 然而有些EV的研究會使用全血來進行, 這會造成要從其他的高豐度粒子物質中區別出EV是非常困難的, 且這種來源物還會被排除在EV的儲存和提取之外, 所以其應用的數量就被限制了。
血漿和血清就會做為主要的EV來源。
血漿會優於血清的EV來源是由於以下因素:
1. 當準備血清時, 多餘的EVs會在血塊形成的過程中被釋放出, 這會造成樣品無法真實的反映出的原始的EV組成分。
2. 血小板衍生的EVs會在收集後被釋放出, 在血清內會有明顯的EVs數量, 這樣就會很難得到低豐度EVs中的靈敏分析結果。

血液收集

血液收集的條件會很明顯的影響在血液樣品中的EV分佈的數量與表徵。收集的變數例如儲存溫度、運輸狀態、儲存時間、凝血劑和離心的方案都必需在所有的樣品中保持一致, 每個因素都會在處理樣品時影響EVs的數量。
1. 凝血劑的選擇可能會影響下游的分析, 如下列表1。
2. 血小板可能會在靜脈穿刺時的物理作用力而被活化, 所以應該丟棄血液收集的前1-3 mL, 以避免止血帶壓力和成纖維細胞的汙染的影響。
3. 最好不要對溶血樣品中的EV進行測量; 如果包含有溶血樣品時, 得到的分析結果就需要非常謹慎的解釋, 且需要測量溶血的程度。

樣品處理
1. 採集血液後, 使用離心的步驟來移除多數的循環細胞(例如紅細胞和白細胞), 這些細胞種類會在採集後釋放EVs於血液中。盡可能的限制採集與第一次離心的時間區隔是很重要的, 理想是在30分鐘內, 最多不要超過60分鐘。
2. 血小板會比血液細胞還要小, 需要特定的條件來去除。如果血小板的EVs不在研究的範圍內, 當其仍存在於樣品中時, 血小板的活化(釋放EVs)就應該小心地避免: 降溫可能會活化血小板, 因此離心的步驟要在室溫下進行; 剪切可能會活化血小板, 因此樣品需要保持直立並避免運輸的壓力和攪動。

EV提取前的儲存
除非能立刻純化與分析血漿/血清衍生的EV, 那麼短期或長期的樣品儲存就是需要的:
1. 所有的樣品都要儲存在一樣的溫度和一樣的時間以限制EV功能化的影響。
2. 在-80度下儲存, 會表現出EV數量維持的最好結果。
3. 在少量血小板和無血小板的血漿樣品中, MicroEVs可能會在低溫條件下增加數量。
4. 冷凍的樣品不應該與新鮮的樣品做比較。
5. 需保持最小化的凍融循環。

qEV 提取
1. qEV提取管柱有廣泛的範圍可用於不同的EV粒徑範圍與樣品體積, 以滿足各種血液衍生EVs的研究中。
2. 新世代的Gen 2 qEV管柱是由專利性的瓊脂糖樹脂製做而成, 可傳達更純的內含胞外體(EV)的流體, 比舊版的Legacy qEV管柱可移除更多的汙染性蛋白。
3. 更多內容, 請參閱 產品介紹-試劑耗材-qEV column 頁面。