[賀: Microbiology Spectrum (IF 9.043) 期刊文章發表 – 由具廣泛的耐藥性的按蚊伊莉莎白菌釋放的以抗生素誘導之外膜囊泡的蛋白質組學網絡]

簡介:
恭喜刊登於Microbiology Spectrum(2021年IF為9.043)的有關外膜囊泡(Outer Member Vesicles, OMVs)的研究文章(Chiang et al. 2022), 利用了我們的Exoid(TRPS)奈米粒徑分析儀和qEV10 column(SEC)研究了由醫院源性的細菌病原體產生的OMVs。
qEV column(SEC)加上可調式電阻脈衝傳感(TRPS)分析的組合已被廣泛用於分離純化和表徵(粒徑、濃度和Zeta電位)來自多種樣本和細胞類型的胞外體(Extracellular vesicles, EVs)研究中, 在Chiang等人發表的這篇文章中使用的是qEV10 (10毫升上樣量的SEC column)從醫院(起源於醫院)細菌病原體的大型培養物中分離出OMVs, 並使用Exoid來確定在不同抗生素條件下生長的細菌分離出的OMVs的Zeta電位變化。

按蚊伊莉莎白菌 (Elizabethkingia anophelis)：一種與衛生保健相關的危險威脅
在最初從蚊子中分離出按蚊伊莉莎白菌後, 人們開始認識到它與一系列和衛生保健有關的感染有關, 包括菌血症、下呼吸道感染、肺炎和新生兒腦膜炎。
在大多數情況下, 這些病例是會在免疫功能低下的人或早產兒中發現的, 他們不僅更容易感染蚊伊莉莎白菌, 而且引起的發病率和死亡率也明顯更高。
此外, 在感染菌株中也存在著多種微生物藥物耐藥性而導致臨床挑戰增加, 因為成功的抗生素治療方案變得稀少, 因此, 對蚊伊莉莎白菌感染機制的深入瞭解可能有助於未來開發出有效的抗菌療法或針對病原體的疫苗。

外膜囊泡OMVs是什麼類型的EVs?
像哺乳動物一樣, 細菌的EVs也可以由不同的生物發生機制而產生。然而外膜囊泡(OMVs)是專門從革蘭氏陰性菌細胞的外膜衍生出來的EVs, 這點在我們官網的”外泌體實驗流程-提取細菌胞外體之差異與相同要點”也已經有專門的介紹, OMVs會攜帶著多種分子信號, 在細菌生命週期的不同階段以及與其他細菌或宿主的交流中會具有多種重要的生物學作用; 此外, 細菌快速的生長速度也允許細胞對環境的快速生理反應, 會轉化為快速釋放新的OMVs以適應外界的刺激。
根據文章報導, 各種應激條件常會影響OMVs的產生、組成和生物發生機制—包括使用抗生素, 重要的是要研究OMVs及其成分變化就必須要有一種可靠的OMVs分離方案, 以支持快速、準確地純化OMVs; 為了更好地瞭解該細菌如何利用其生存特性、毒力和抗生素耐藥性, 本研究的目的是研究按蚊伊莉莎白菌的OMVs在抗生素誘導的應激條件下的作用。

抗生素誘導的按蚊伊莉莎白菌OMVs在致病性中有作用嗎?
作者首先採用紙片擴散法和微量稀釋法對兩株按蚊伊莉莎白菌的藥敏性進行了鑒定, 確認了菌株C08的多耐藥表型, 然後從不同抗生素的次最低抑制濃度(sub-minimum inhibitory, sub-MIC)的C08培養基中分離出OMVs。
簡單地說, 細菌細胞通過離心(6000 xg, 20分鐘，4⁰C)和過濾(0.22 μm)從培養物中分離; 無細胞上清經100 kDa切向流過濾(TFF)濃縮至10 mL。濃縮上清再通過qEV10 column (AFC自動提取機), 收集含有OMVs的餾份(EV-zone), 再用差速離心(150000xg, 3h, 4⁰C)洗滌並沉澱。
接著對純化後的OMVs進行了形貌、顆粒數和粒徑的表徵, 並用Exoid(TRPS)奈米粒徑分析儀測定了OMVs的Zeta電位。最後在該研究中, 通過液相色譜-串聯質譜法, 從使用抗生素亞胺培南或未經抗生素亞胺培南培養的細菌中鑒定與OMVs相關的蛋白質, 並進一步進行蛋白質富集分析。

亞胺培南誘導的OMVs蛋白質組學分析揭示了其在按蚊‍伊莉莎白菌存活中的作用
OMVs的特徵顯示出在不同抗生素下生長的細菌的分析參數有明顯的差異, 突出表明了氯黴素處理細菌的OMVs蛋白質含量最高；亞胺培南處理菌的OMVs濃度和大小均勻性最高；阿米卡黴素處理過的細菌中OMVs的Zeta負電位排第二(第一名是未處理的細菌)；接受二甲胺四環素處理的細菌每個細胞產生的OMVs最多。
蛋白質組學分析顯示, 來自亞胺培南處理的細菌的OMVs有20個獨特的蛋白質(總共126個), Gene Ontology分析顯示與碳水化合物運輸和代謝相關的途徑富集發生了顯著變化。在亞胺培南處理和未處理的細胞中, 鑒定的OMVs蛋白定位相似, 51-52%來自外膜。

蛋白質-蛋白質相互作用網路分析證實了蛋白質富集的差異, 體外實驗進一步證實了這一點：從亞胺培南處理的細菌中純化的OMVs降低了肺上皮細胞的活力,  降低了巨噬細胞的細菌殺傷率。此外, 來自亞胺培南處理過的細菌OMVs對亞胺培南的水解(碳青黴烯酶)活性與來自未處理的細胞的OMVs相比較並沒有差異, 這表明在抗生素耐藥性中並沒有作用。

適應性反應的證據?
總的來說, 暴露於亞胺培南的按蚊伊莉莎白菌OMVs被證明轉變為一種免疫相關表型—這種表型似乎對細菌生存至關重要, 而不是增強抗生素耐藥性。在本文研究的其他抗生素條件下釋放的OMVs的廣泛物理特徵表明, 其他OMVs的成分變化可能值得再進行研究以尋找按蚊伊莉莎白菌感染中潛在的生物學意義。

參考文獻:
Chiang MH,Chang FJ, Kesavan DK, et al. Proteomic Network of Antibiotic-Induced OuterMembrane Vesicles Released by Extensively Drug-Resistant Elizabethkingiaanophelis. Edelmann MJ, ed. MicrobiologySpectrum. 2022;10(4). doi:10.1128/spectrum.00262-22