[比較五種用於分離純化”乳汁”來源的胞外體的方法]

簡介:
Morozumi et al. (2021)對比了六種商業的分離純化商品與超高速離心法(UC)從牛奶中分離純化胞外體的表現差異。
概要:
因為從乳汁中提取的胞外體(Extracellular vesicles, EVs)可具備有潛在的治療作用、藥物傳遞載體的功能和在監測動物健康方面的實用價值而已備受關注, 我們最近詳細討論了乳汁-EVs的重要性, 並解析了乳汁的成分、前處理方法的影響和EVs純化方式的考量。
在此我們分享一篇關於純化乳汁-EVs的研究(Comparison of isolation methods using commercially available kits for obtaining extracellular vesicles from cow milk), 其評估了前處理方法如何與不同的EVs分離純化方式結合, 以確定出所建議的最純淨而最有效率的組合方針。
原文的結論發現使用醋酸酸化 + qEV column (SEC, 尺寸排阻色譜)結合的方法可獲得純度和產量較高的乳汁來源的EVs: “We found that SEC-based qEV column (Izon Science) could collect purer milk-derived EV at higher quantities. Thus, a combination of acetic acid precipitation and qEV can effectively isolate high amounts of pure extracellular vesicles from bovine milk”。
討論:
乳汁的前處理即為去除細胞和脂肪球而這可以通過初步離心方式來進行, 在本研究中一開始在去除”酪蛋白膠束”之前, 是先對生牛奶進行兩次(1200xg, 4℃，10分鐘)的冷凍初步離心。
接下來作者研究了三種前處理方法來去除酪蛋白膠束, 分別為: 離心、酸化(醋酸)和EDTA解離, 然後分別和下列的EVs分離純化商品做組合:
1. 超高速離心法(UC)
2. 膜親和純化(Affinity) - ExoEasy Maxi Kit
3. 尺寸排阻色譜(SEC) - qEV column 或 EVsecond L70
4. 高分子聚合物沉澱試劑盒(PEG kit) - ExoQuick-TC 或 Total Exosome Isolation Kit
5. 免疫親和純化(Beads) - MagCapture Exosome Isolation Kit
當涉及到EVs”純度”時, 使用離心法做為酪蛋白的前處理去除步驟效果最差, 可能是由於EVs也被同時移除的緣故, 而在酸化和EDTA解離的前處理步驟中, 結合qEV的純化分離就得到了非常高純度的EVs (如下圖, 原文圖1C), 其中酸化前處理是最成功的方法, 這種酪蛋白去除方法也會被用於進一步分析。

就純度而言, 在第二輪的酸化實驗中, SEC的qEV和Beads的免疫親和純化的表現最好, 分離出的EVs有著幾乎完全相同的平均粒徑(如下表, 原文表1)。

進一步對比可看出qEV所得到的EVs濃度和EVs-RNA含量是最多的, 而Beads免疫親和在這些指標中表現並不好(如下圖, 原文圖2b/2c)。
用qEV分離可檢測到相對多的EVs標記物如CD81和TSG101(如下圖, 原文圖2D), 而這兩種標記物的條帶在膜親和純化與免疫親和純化方法下都呈現出較淡(如下圖, 原文圖2D), qEV分離也會得到最乾淨的透射電子顯微照(如下圖, 原文圖3A)



而作者的最後總結是, 現存主要商品中, 以qEV純化的操作耗時短、EVs分離純度高、EVs粒子濃度高、萃取之EVs-RNA得率高(如下表, 原文表2)。

參考文獻: Morozumi, M., Izumi, H., Shimizu, T., & Takeda, Y. (2021). Comparison of isolation methods using commercially available kits for obtaining extracellular vesicles from cow milk. Journal of dairy science, 104(6), 6463–6471. https://doi.org/10.3168/jds.2020-19849