簡介:
滑液是一種高度粘性的生物液體, 含有免疫細胞衍生的胞外體, 這可能是關節炎的關鍵, 但我們應該如何分離純化其胞外體? 而我們已經知道了什麼進展了呢?
概要:
滑液(Synovial Fluid, SF)是滑膜關節囊內作為減少摩擦的液體。滑膜關節是人體最常見的關節類型, 例如髖關節、膝關節和肘關節。這些關節易患有關節炎如風濕性關節炎和骨關節炎。由於滑液是在這些情況下的組織受損/炎症周圍的生物液體, 其在受影響關節中的成分, 可能是瞭解發病機制和疾病的關鍵。在尋找答案的過程中, 滑液衍生的胞外體(SF-EVs)引起了研究人員的興趣。EV是奈米尺度的囊泡, 其攜帶的蛋白質、核酸和來自細胞起源的小分子會被包裹在脂質雙分子層中。這些貨物可以被運送到目標細胞, EV在那裏可以有各種各樣的影響。EV的這些特徵做為生物標誌物非常具有吸引力, 也使其對於理解疾病的發病機制(如滑膜關節疾病)是至關重要的。在這裡我們將討論滑液的成分及其對分離純化EV的影響, 然後突出SF-EVs的關鍵研究。
討論:
滑液的成分
滑液中的主要細胞類型是免疫細胞, 這被認為是SF-EV的主要來源[1]。與大多數炎症的情況一樣, 關節的炎症與白細胞的大量浸潤有關, 這使得免疫源性的EV成為SF-EVs研究的主要重點[2]。為了能夠有效、純粹地分離純化EV, 必須對滑液的非EV成分有一個基本的瞭解。
與腦脊髓液一樣, 滑液是血漿的超濾液, 大約有三分之一的血漿總蛋白濃度[3]。雖然蛋白質含量相對較低, 但SF-EV濃度還是未知的。這意味著EV與蛋白質的比例目前還無法與血漿進行比較——而大多數血漿的EV分離方法都有得到了優化。 已知與血漿不同的是滑液的”粘度”, 其粘度與生的蛋白類似。與其他體液相比, 粘度是滑液最大的特徵, 因為關節內的潤滑特性需要這種粘度。這種粘度主要來自粘彈性透明質酸的存在, 其是一種高分子量的糖胺聚糖聚合物[4]。 透明質酸與蛋白多糖潤滑素一起, 由滑膜上的成纖維細胞樣細胞分泌, 這些細胞排列在關節囊的向內一側[5]。透明質酸和潤滑素都有助於滑膜液的非牛頓粘度, 這表明滑膜液在純力作用下會變薄[6]。 黏度在疾病中也會發生改變[7], 這對受黏度作用的EV純化分離方法(如超高速離心UC)具有一定的影響。
從滑液中分離純化EV的注意事項
如前所述, 從滑液中分離純化EV的最大考慮因素之一是透明質酸, 這導致許多研究在流程中需要添加透明質酸酶。 然而, 唯一有報導了透明質酸酶造成的影響是其會增加10000 x g時的沉澱顆粒和減少100000 x g時的沉澱顆粒, 同時顯示了CD44陽性的EV增加[8]。透明質酸可以附著上SF-EV[9]。目前只有一項關於該問題的研究發表, 而透明質酸酶對EV純化分離的回復率的影響也尚未達成共識。 然而有更多的證據表明SF-EV分離方法會對已純化的EV品質有影響。
Foers等人(2018)試圖比較傳統的超高速離心法(UC), 密度梯度離心法(DG-UC)與尺寸排除色譜法(SEC)從滑液中分離純化EV的效果[10]。 UC和DG-UC方法都會存在大量的高密度脂蛋白污染物, 並在透射電子顯微鏡照片中觀測到普遍的非晶態物質。 然而使用SEC法, 高密度脂蛋白標記物與EV標記物會很好的分離開, TEM的照片會更乾淨, 這意味著SEC被推薦為最好的技術[10]。然而在這項研究中使用的SEC所操作的時間非常長(150分鐘), 這使得其不適合做高通量研究, 甚至不適合低通量研究[10]; 而現在, 使用qEV尺寸排阻色譜管柱只需15分鐘就完成, 這讓相關的研究可以更規模化。Chen等人(2022)的一項研究證實了qEV管柱的效率, 該研究比較了UC法、沉澱法和qEV的SEC法[11]。qEV管柱是文中最快、最純淨的分離方法, 可去除大部分的蛋白質污染物[11]。與Foers等人(2018)所操作的很耗時的SEC不同, Chen等人(2022)所使用的SEC(qEV管柱)在EV的餾分中沒有顯示纖維蛋白網污染物。因此, 不僅文獻表明SEC是相對優秀的方法, 而且也推薦qEV管柱和相關的qEV series[10,11]。
關節炎的比較：滑液的胞外體的研究
雖然有很多種關節炎存在, 但最常見的還是骨關節炎和類風濕性關節炎。類風濕性關節炎被形容為炎症性關節炎, 雖然炎症確實在類風濕性關節炎的發病機制中起著更大的作用, 但這在一定程度上卻很不準確地低估了炎症在骨關節炎病情的持續發展中的作用。大量關於SF-EV的研究也將兩者進行了比較, 但由於從健康患者收集滑膜液會有其倫理的限制, 這些研究常常使用骨關節炎作為對照組。 因此這些研究中可能遺漏了SF-EV在其中一種關節炎或在兩種關節炎下的變化。 儘管只把類風濕關節炎和骨關節炎做比較的方案有其缺陷, 但多項研究發現, 與骨關節炎相比, 類風濕關節炎中的EV的數量明顯更高[12-14]。這表明SF-EV在類風濕性關節炎中可能會非常重要。
大多數SF-EV研究主要集中在研究其EV的起源, 主要是在免疫細胞標記物上。這些研究表明, 類風濕性關節炎中的EV富集來源於成纖維細胞[13]、T調節細胞[12]、CD4+ T輔助性細胞[15]、CD8+細胞毒性T細胞[1,15]、單核細胞[15,16]、血小板[17]，以及一般的粒細胞[15]和特定的中性粒細胞[12,13,16]。相反的, 骨關節炎的EVs富集來源於活化的T細胞[18]、巨噬細胞[18]、B細胞[18]和自然殺傷細胞[18]。但是這些免疫衍生的EV會有什麼作用呢?
類風濕關節炎患者的SF-EV中的蛋白分析可表示其富集於補體和凝血級聯蛋白以及那些參與趨化作用的蛋白[14]。一項研究發現, 來自類風濕性關節炎患者的SF-EV可導致滑膜的成纖維細胞樣細胞產生更多的細胞因數和其他在骨關節炎和類風濕性關節炎中已知作用的蛋白質[20-22]。當比較兩項研究中的SF-EV-蛋白在類風濕關節炎和骨關節炎中的變化[13,14](下圖)時, 兩個研究的資料集中出現的最高變化的類風濕關節炎EV蛋白是其生物標誌物S100A9[23,24]。 另一種在類風濕關節炎SF-EV中有上調的蛋白是Vimentin(下圖)。Vimentin的瓜氨酸化形式會存在於SF-EV[25]中, 是類風濕關節炎患者的一個重要的自身抗原[26，27]。在列表上的其他蛋白質(下圖)也被證明與類風濕性關節炎或發生改變有關。因此，類風濕關節炎中的SF-EV有可能會使炎症持續發生。
此外, 類風濕關節炎患者中的這些SF-EV也含有靶向細胞因數途徑的miRNAs, 且有高度豐富的抗炎妊娠區蛋白, 可提示其有參與調節炎症[14,28]。這種促炎和抗炎性質可能在同一個EV中共存, 也可以在來自不同細胞來源的EV的不同亞群中做分離。已有研究表明, 來自骨關節炎患者的中型EV代表了大多數B細胞來源的EV, 然而大型和小型的EV也都會富集在巨噬細胞來源的EV[18]中。 該領域的研究目前使用大量不同的EV分離純化技術, 這可能會導致使用分離不同亞群的研究之間會缺乏一致性, 這可以透過採用單一種對SF-EV純化分離中表現良好的標準化方法來改良, 比如選擇qEV純化管柱。
SF-EV研究的關鍵問題
為了使該領域朝著產生臨床效益的方向發展, 我們通常會考量幾個關鍵問題:
1. EV是否顯示是由這些免疫細胞所產生的免疫細胞標記?
當一個EV對免疫細胞標記物呈陽性時可假設該免疫細胞是該EV的來源, 然而目前還不確定這是否完全正確, 也不確定這些EV是否來源於關節疾病病理中異常表達這些蛋白的其他的細胞。
2. 由於缺乏健康者的對照組, 研究是否遺漏了潛在的重要生物標誌物或治療候選物?
由於倫理規範, 幾乎所有的SF-EV研究都將骨關節炎作為對照組, 然而免疫失調也有明顯存在於骨關節炎關節。
3. SF-EV的純化分離方法的標準化能否提高研究之間的一致性?
目前在不同的研究中, 採用於EV純化分離的來源細胞之間會存在很大的不一致性, 這表明需要有更大的研究組群、標準化的方法和系統的綜述。
關於SF-EV的研究已經指出了其潛在的炎症(和/或抗炎)作用, 但SF-EV對其周圍組織的影響還有待充分確定。 這些微小的囊泡可能是炎症性關節疾病新的治療靶點的關鍵嗎?
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