2014年, 國際細胞外囊泡協會 (ISEV) 基於現有的細胞外囊泡研究論述而完成了關於"細胞外囊泡及其功能定義的最低實驗要求"
2018年, 基於不斷更新及改良的現況, ISEV 又更新並發表了 Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018)

做為在 EVs 領域的指定合作單位, 我們替您解析了 MISEV2018 的更新內容如下:

• 命名法

細胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 指的是經細胞釋放而具有脂質雙分子層的顆粒, 不能複製即不包含具有功能的核心
而胞外體 (Exosomes) 和微粒/微囊泡 (Microvesicles) 都是 EVs 的亞分類, 目前並沒有單一技術可完全證明所屬是哪一種, 這代表我們需要建立一個完整的驗證模式, 比如依據 EVs 的物理特性、生化成分、處理條件、細胞起源或是依自有的發現法命名, 如果無法依照 MISEV2018 的方法命名, 我們的建議是用微粒 (Extracellualr Particles, EP) 取代
可是胞外體 (Exosomes) 的說法實在很吸引人, 相較下 EVs 的稱呼似乎沒這麼好用, 我們可以建議您針對計劃書、專業性期刊或是囊泡相關的期刊的說法, 歡迎進一步聯絡我們

• 樣品的前處理

包含細胞條件培養液、生物體液和組織等類型
如何去除細胞條件培養液中 FBS 的 EVs -
1. 配置好的培養液 (或 20% FBS 培養液), 以 100,000g/18 hrs 離心
2. 配置好的培養液 (或 20% FBS 培養液), 以 200,000g/1 hr 離心
3. 使用切向流過濾或是超濾法 (100Kd)
以上的建議還是有補充的注意事項而不一定都可接受, 歡迎進一步聯絡我們

• 樣品的儲存

目前已知的保存條件都還可接受並沒有通用的共識形成, 雖然不會影響顆粒濃度但會有粒徑分佈的變化(聚集), 在功能研究的影響不大

• 提取方法的選擇和純度評估

依 MISEV2018 的說法, 提取的方法可分為:
1. 高回收, 低純度 : 主要是目前市面上各種以 PEG 為主的沉澱試劑盒 (Kit)、低分子量截流的超濾、UC 超速離心法等
2. 適中回收, 適中純度 : 包含 SEC 尺寸排阻色譜法、高分子量截流的超濾、差速離心法、切向流過濾、親合層析法
3. 低回收, 高純度 : 結合以上的兩種方式, 例如 UC + SEC, 密度梯度離心或免疫親和捕獲
4. 高回收, 高純度 : 目前還沒有已被承認的方式
那麼要如何選擇合適的提取方法呢, 主要還是依照您的實驗目標和樣品種類來考量, 歡迎進一步聯絡我們

• 細胞外囊泡標記物的表徵策略

依 MISEV2018 的說法, 要有兩個陽性蛋白和一個陰性蛋白標記物, 我們的建議是先做跨膜蛋白 Tetraspanins (主要是 CD63, CD8, CD81, CD82) 再做膜內標記 (主要是 Allx, Tsg101)
在 MISEV2018 Table 3. 內有基於蛋白質含量的 EV 表徵描述 - 
1. 與質膜和/或內體有關的跨膜或GPI錨定蛋白
2. EVs 中保留的胞漿蛋白
3. 非 EVs 共分離結構的主要組成部分
4. 除 PM/內體外與其他細胞內區室相關的跨膜、脂質結合和可溶性蛋白
5. EVs 保留的分泌蛋白
第4點和第5點一般為有特異來源時才考慮, 歡迎進一步聯絡我們

對於單一囊泡的表徵, 需要使用兩種不同但互補的方法:
1. 例如 AFM 的 SPM 和高分辨率的顯微鏡, 注意要同時提供專一的圖像和廣泛的圖像
2. 利用顆粒分析技術, 例如 TRPS、NTA、FC 等

• EV 的定量和樣品歸一化

對顆粒濃度(數目): TRPS、NTA、FACS、AFM
對蛋白定量: Bradford / BCA (總蛋白)、ELISA (特定蛋白)
對脂質或 RNA 總量: 目前尚無已成熟的策略, 仍在確定中
對於歸一化, 目前 EV 研究中還沒有公定的內參, 但文獻內有使用外參的說法, 歡迎進一步聯絡我們

• 確認特定分子與EV的拓樸結構

主要是確定所屬分子是在囊泡上或是囊泡內, 抑或是在提取時共沉澱形成的; 注意小心的設置對照組, 歡迎進一步聯絡我們
例如:
1. 未經過任何處理的樣品
2. 只用降解酶處理的樣品
3. 使用降解酶和洗滌劑處理
4. 只用洗滌劑處理

• 證明 EV 及其內容物與功能的關聯

法1: 以密度梯度提取 EV, 在功能研究中分別測定每個梯度的活性表現
法2: 以 SEC 管柱提取 EV, 在功能研究中分別測定每個餾分的活性表現
法3: 比較完整的 EV 和經洗滌劑處理的活性, 但此法會有些技術的侷限性, 歡迎進一步聯絡我們
法4: 以過量的免疫親和捕獲以去除實驗內的 EV, 檢測此和對照組的功能是否有對應現象
總之, 原理即是去除 EV 中的特定分子, 確認功能研究中的 EV 是否不再具有對應現象, 也有使用電轉去除法 (Electroporation)

以上內容即是我們替您整理的 MISEV2018 解析, 如有任何建議歡迎留言聯絡, 希望大家都能實驗順利喔 (非經許可請勿任意複製轉發分享)