如何從血液的樣品内提取高純度的細胞外囊泡(胞外體)

ISOLATING EVs FROM BLOOD PRODUCTS USING qEV

使用 qEV Columns (SEC) 提取血液樣品的細胞外囊泡(胞外體)

細胞外囊泡(EVs)是由多種活化和凋亡的細胞所產生的膜衍生物的廣泛分類。
EVs的分類包含胞外體(exosomes)、微囊泡(microvesicles, 有時稱為microparticles微粒) 、脂質體(oncosomes)和其他囊泡(vesicles), 由其細胞來源、粒徑和表面標記物來定義。
他們被用來在細胞間傳遞訊息, 而其用來將分子轉運到特定的靶細胞群的功能使他們在診斷和預後的發展更具吸引力, 提取EVs的主要生物流體的代表物是血液(Blood), 而其在分析前的階段(樣品收集)可能是變異的重要來源
這有很大的程度上是由於血細胞, 尤其是血小板(platelets)可以很容易被活化并在樣品採集和處理的過程中釋放EVs。
血小板可以在一般的血液處理過程中所使用的許多分子和條件下活化, 因此, 重要的是所使用的樣品收集和處理方案必須注意(A)防止血小板活化和(B)在儲存和分析前去除血小板
<注意事項和建議>
EVs分佈的檢測和表徵通常會與樣品處理和提取過程中產生的人爲產生物混肴; 採集的過程會改變分子完整性、功能和(或)生物標本的組成, 因此必需特別注意所選擇評估的樣品介質(全血、血漿或血清)、采血與處理的方法

樣品的介質

樣品介質的種類在EVs分析研究的設計上是一個重要的考量點, 然而有些EVs的研究會使用全血進行, 此介質會阻礙EVs的提取和儲存所以應用的數量被限制了
血清血漿是主要使用的樣品種類, 由於以下因素所以血漿比血清更適合作爲EVs的來源--

1. 當準備血清時, 多餘的EVs會在血塊形成過程中釋出
2. 血清中的囊泡數量會高於血漿
3. 採集后所釋放的由血小板所衍生的EVs可能會是血清中大量EVs的原因

血液的採集

採集的條件會很大的影響血液樣品中EVs分佈的數量和表徵
採集的變異例如儲存溫度、運送狀態、儲存時間、抗凝劑(anticoagulant)和離心的方案都要在所有的樣品中維持一致, 因爲這可能會影響已處理樣品内的EVs數量

1. 最好在早上時由空腹的患者上採集
2. 靜脈穿刺的過程中可能會活化血小板; 應丟棄前1-3 mL採集的血液因其會有止血帶的壓力的活化效應和成纖維細胞的污染
3. 最好不要對溶血樣品中的EVs進行測量, 如果要包含溶血樣品, 則要仔細解釋包含溶血程度在内的測量結果
4. 抗凝血劑的選擇可能會影響到下游的應用, 如左表所示--

處理血液的注意事項

1. 血液採集后會將其離心以除去血小板、紅血球和白血球, 這些物質都會在採集后在血液中釋放EVs
2. 盡可能地限制採集后和第一次離心之間的時間是很重要的, 理想在30分鐘内最多不超過60分鐘
3. 使用的處理步驟可能會取決於所要詢問的特定科學問題而定, 然而一般的指導方針如左表--

材料

抽空的采血管*2

≥21號的針頭*1

個人防護設備

止血帶

輸血設備

防尖銳穿刺的容器

帶有可旋轉轉子並能2500g/15分鐘的離心機

1000 µL的移液器(pipette)

200 µL的移液器(pipette)

新鮮的1X PBS溶液

無菌的0.22µm過濾器

無菌的注射器

Izon 的 qEV Columns (胞外體提取管柱)

血液採集和處理方法

1. 最好在早晨(0800-1100)時從空腹的志願者中採集血液

2. 施加輕微的止血帶,並用≥21號的針頭刺入肘前靜脈

3. 丟棄前2-3 mL的血液

4. 採集最小3.5 mL/管的血液*2

5. 輕輕顛倒試管8-10次以使血液與抗凝劑混合

6. 讓試管在室溫(20-24度C)下孵育不超過60分鐘

7. 將試管在室溫下二步驟離心2500g/15分鐘

7.1 確保制動已關閉

7.2 使用帶有旋轉轉子的離心機(與固定轉子相反)

8. 從頂部採集血漿后並用1000 μL的移液器將其放入新試管中
注意: 不可擾動血沉棕黃的外層(白血球和紅血球上方的血小板層), 如果有擾動了外層就需要再次進行初步離心

9. 再次於室溫下以2500g/15分鐘離心血漿

10. 使用200 µL移液器從試管頂部抽出將血漿收集到新試管中,並在試管底部保留約100 µL血漿

11. 使用液氮速凍血漿並保存在-80˚C

使用qEV Columns (胞外體提取管柱)提取EVs

1. 準備新鮮的1X PBS溶液並以0.22 µm注射過濾器進行過濾

2. 使用室溫的PBS溶液平衡qEV Columns

2.1 除氣和室溫的緩衝液將有助於避免在凝膠床中形成氣泡

3. 解凍血漿樣品並將適量的樣品放入qEV Columns的上孔内

3.1 確認樣品的體積和所選的qEV Columns型號相符

4. 依照所附的説明書指示開始收集空隙體積和樣品餾分

4.1 不同的樣品可能會有輕微不同的冲緹曲綫和純度, 建議對所收集的餾分中的EVs濃度和蛋白質污染物進行初步測量。

5. 在樣品餾分都被收集了之後, 使用1.5倍管柱體積的緩衝液衝洗後即可放入其他的樣品或將管柱存放以供後續使用

6. 將管柱存放在4-8度C下

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