如何從細胞上清液内提取高純度的細胞外囊泡(胞外體)

ISOLATING EVs FROM CELL CULTURE MEDIA USING qEV

使用 qEV Columns (SEC) 提取細胞上清液的細胞外囊泡(胞外體)

細胞培養是在實驗室內模擬細胞過程的必要模型系統。細胞培養可被用以診斷疾病、篩選新藥或製造治療物質。細胞培養基(CCM)的細胞所釋放的細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)可視為一種生物標記物而用以開發現代醫學中優異、敏感且微創的診斷替代方法。
一個從高產率的條件培液中可靠而標準的提取EVs的方法可以顯著的提高其在研究目的的用途。
以管柱為基礎的尺寸排阻色譜法(Size Exclusion Chromatography, SEC)可提供一個不影響EVs結構和功能的乾淨樣品; 而使用AFC自動提取機(Automatic Fraction Collector)的自動過程更可通過減少手動錯誤的範圍進一步提高樣品提取的再現性。

注意事項和建議

所有的智能qEV columns都可在兩種提取範圍內擇一, 分別是qEV/35nm系列和qEV/70nm系列。
為了最佳回收在35~350nm範圍的顆粒, 建議使用qEV/35nm系列的管柱; 而最佳回收在70~1000nm範圍的顆粒, 則建議使用qEV/70nm系列的管柱。

樣品採集

EVs的產量取決於細胞系/細胞密度/孵育時間

胎牛血清(FBS)是最常用的補充劑, 使用超高速離心(ultracentrifugation)或切向流過濾(TFF)的分級提取有助於擺脫FBS引起的EVs

EVs提取方法

在使用SEC之前, 超高速離心(ultracentrifugation, UC)被廣泛的使用於提取EVs, 其所使用的強大力量(高達100,000xg)會破壞並使囊泡聚集而讓許多的研究失效
目前觀察到的是, 由於較高的流速, 以壓力驅動的濃縮過程更適合體積大於400mL的樣品, 而其只會在前50-100mL的CCM中觀察到胞外體的損失
使用qEV提取可移除汙染性蛋白和其他在細胞培養樣品中的小顆粒而剩下平衡在PBS中的純淨EVs樣品。根據所獲得的最終CCM體積, 上表1可用來選擇正確的qEV以符合您的研究

樣品上樣量與濃度

在將樣品放入管柱前, CCM內的蛋白濃度應 < 70 mg/mL
輸入更高的樣品體積會導致在之後的囊泡體積中的純度降低, 而蛋白質和EVs的洗脫峰之間的重疊會更大且在EVs區中會有更高的蛋白峰值。例如, 在qEVoriginal中理想純度的樣品推薦體積為500 μL而其會使囊泡在1.5 mL的EVs區中有一致的洗脫峰
更高的CCM體積(> 50 mL)會需要適合的濃縮過程以達更好的EVs產率。以離心為基底的濃縮機是最適合的設備, 而有些應用可能會需要使用更大體積的CCM (4-5 L), 但對生物反應器來說, 其並不需要預濃縮步驟。
對於包含蛋白質組學和功能測定的大多數目的來說, 推薦使用含Ultracel-10 membrane 的 Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Unit (MWCO = 100kDa; Millipore, Billerica, MA)

材料

CCM收集裝置
可達10,000xg的離心裝置
Amicon® Ultra centrifugal filters
Micro-pipettes
新鮮的1X PBS溶液
無菌的0.22 μm注射過濾器
無菌的針筒
Izon’s qEV columns
Izon’s AFC (Automatic Fraction Collector)

方法

1. 準備新鮮的 1X PBS 溶液且使用0.22μm 過濾器過濾
2. 使用室溫的 PBS 溶液以平衡 qEV 管柱
    a. 除氣和室溫的緩衝液將有助於防止在凝膠床中避免形成氣泡
3. 依照使用手冊準備AFC 並將樣品輸入到表1 中列出的合適 qEV 管柱上
    a. 確認樣品的體積以確認 qEV 管柱的類型

A. 使用 qEVsingle SEC 管柱從CCM樣品中提取EVs

1. 小心的移除細胞培養上清液(<15 mL)
2. 設定500xg/10mins 離心上清液後再設定10,000xg/10mins
3. 使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units (MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA) 旋轉上清液
4. 通過反覆的離心以濃縮至最終體積為100-150μL
注意: 如有必要, 使用1xPBS 調整至最終體積至150μL
5. 在qEVsingle管柱上放入所調整的體積
6. 立刻開始收集空隙體積(1 mL, void volume)
7. 之後開始收集EVs體積(600 μL)且使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units (MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA) 濃縮
8. 此EVs即已準備好進行下游應用, 建議使用TRPS分析進行EVs定性和定量

B. 使用 qEVoriginal SEC 管柱從CCM樣品中提取EVs

1. 在移除細胞碎屑後得到上清液(15-100 mL)
2. 接續section A 裡的第二點和第三點
3. 通過反覆的離心以濃縮澄清的上清液至最終體積為500-1000μL
4. 在qEVoriginal管柱上放入 500-1000μL 的濃縮樣品且使用PBS 流洗
5. 立刻開始收集空隙體積(3 mL, void volume)
6. 之後開始收集EVs體積(1.5 mL)且使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units (MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA) 濃縮
7. 此EVs即已準備好進行下游應用, 建議使用TRPS分析進行EVs定性和定量

C. 使用 qEV2 SEC 管柱從CCM樣品中提取EVs

1. 在移除細胞碎屑後得到上清液(100-400 mL)
2. 接續section A 裡的第二點和第三點
3. 通過反覆的離心以濃縮澄清的上清液至最終體積為2ml
4. 在qEV2管柱上放入 2ml 的濃縮樣品且使用PBS 流洗
5. 立刻開始收集空隙體積(14.25 mL, void volume)
6. 之後開始收集EVs體積(8 mL)且使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units (MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA) 濃縮
7. 此EVs即已準備好進行下游應用, 建議使用TRPS分析進行EVs定性和定量

D. 使用 qEV10 SEC 管柱從CCM樣品中提取EVs

1. 在移除細胞碎屑後得到上清液(400-1000 mL)
2. 設定500xg/10mins 離心上清液後再設定10,000xg/10mins
3. 使用例如Jumbosep™ Centrifugal Devices (Pall Corporation, New York)或Tangential Flow Filtration (TFF)(Minimate™ Tangential Flow Filtration System, Pall Corporation, New York)在30-80 mL/min 流速下濃縮澄清的CCM 至最終體積為5-10 mL。TFF 可採集多達1L或更多的樣品, 並有效的濃縮至5 mL。
4. 在qEV10管柱上放入濃縮的樣品且使用PBS流洗
5. 立刻開始收集空隙體積(20 mL, void volume)
6. 之後開始收集EVs體積(20 mL)且使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units(MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA)濃縮
7. 此EVs即以準備好進行下游應用, 建議使用TRPS分析進行EVs定性和定量

E. 使用 qEV100 SEC 管柱從CCM樣品中提取EVs

1. 在移除細胞碎屑後得到上清液(4-5 L)
2. 設定500xg/10mins 離心上清液後再設定10,000xg/10mins
3. 使用例如Jumbosep™ Centrifugal Devices (Pall Corporation, New York)或Tangential Flow Filtration (TFF)(Minimate™ Tangential Flow Filtration System, Pall Corporation, New York)在30-80 mL/min 流速下濃縮澄清的CCM 至最終體積為100 mL。TFF 可採集多達1L或更多的樣品, 並有效的濃縮至5 mL。
4. 在qEV100管柱上放入濃縮的樣品且使用PBS流洗
5. 立刻開始收集空隙體積(200 mL, void volume)
6. 之後開始收集EVs體積(200 mL)且使用Amicon® Ultra-4 或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Units(MWCO = 100kDa; Merck Millipore, Billerica, MA)濃縮
7. 此EVs即以準備好進行下游應用, 建議使用TRPS分析進行EVs定性和定量

更多的相關訊息歡迎和我們聯絡或來信洽詢info@normanda.com