如何從細胞培養上清液内的樣品中提取高純度的胞外體

ISOLATING EVs FROM CELL CULTURE MEDIA USING qEV

提取細胞培養上清液中胞外體的要點與建議

細胞培養是在實驗室內模擬細胞過程和開發不同的研究領域的必要模型系統, 包含Extracellular Vesicles(EVs, 胞外體/細胞外囊泡)和其他的相關應用。因此, 從細胞培養基(Cell Culture Medium, CCM)提取細胞所釋放的EVs就存在很多優點, 例如CCM可被人為控制和優化, 並提供了一種可大規模生產CCM-EVs的機會。

EV的字面範圍是泛指由各種活性和凋亡的細胞所製造出的膜性實體, 包含exosomes(外泌體), microvesicles(微泡, 有時會稱為microparticles, 微粒), oncosomes(腫瘤小體)和其他的各種囊泡, 而他們都是由其細胞來源、大小和表面的標記物而被定義的

這種特性能使他們在細胞間傳遞訊號, 也可以運送某些物質到特定的目標細胞群, 這就更進一步引起了關於診斷和治療開發領域的興趣


一個穩定、標準化又具可擴充性的以高產率提取CCM中EVs的方法可以顯著的提高其在研究/應用的目的或用途; 通過以管柱為基礎的尺寸排阻色譜法(Size Exclusion Chromatography, SEC), qEV columns可提供一個不影響EVs結構和功能的乾淨樣品, 並可藉由AFC自動提取機(Automatic Fraction Collector)引入自動化流程以大量減少人為錯誤的範圍, 達成上述的目的。

考量與建議

雖然CCM比起血液相關的樣品, 在EVs的提取中更為單純, 但仍有其面對的3點挑戰:
1. 需要準備專門的設備, 在沒有微生物性汙染物中
安全的成功達成細胞培養並取得上清液
2. CCM中如有上述的汙染物就會影響細胞本身, 也會因為微生物自身所釋放的EVs造成實驗的干擾

3. Fetal Bovine Serum (FBS, 胎牛血清)是最廣泛用於細胞培養的"補給品", 而其也有由FBS所造成的相當數量的EVs而污染了CCM的EVs, 進而干擾實驗

以下流程是我們建議的CCM過程和EVs提取的方案

收集樣品

在CCM中的EVs, 其組成和產率取決於多種因素: 例如細胞線、細胞密度、培養液的組成或各種孵化的條件(時間、溫度、氧氣水平等)。

CCM樣品濃度較低, 需要做濃縮 (使用 100 kDa 濃縮管/TFF)
通常EVs在CCM樣品中的濃度不是很高, 一般推薦將CCM樣品進行濃縮以增加接下來qEV提取的回收率, 如果CCM的體積量越大(> 50 mL)時就更需要以此來得到好的EVs產量

類似超濾的離心濃縮機是普遍使用於< 50 mL的樣品體積, 而> 200 mL的CCM體積會使用cross flow filtration (CFF, 或稱為 tangential flow filtration, 切向流過濾)先進行濃縮。
一般使用於濃縮CCM樣品中的EVs的超濾裝置, 都是基於其濾孔的molecular weight cut-off (MWCO), 大約為100, 300或750 kDa這幾種。

以下的表格是我們建議的qEV columns (SEC)選擇的方案

qEV columns (SEC) 現已有6種類型, 可依照進樣體積不同所選, 而每種類型又都有35 nm和70 nm兩種孔徑可用, 詳細介紹可參閱選單-產品介紹-qEV columns

唯一需要注意的是, 經過濃縮後的CCM樣品, 進入qEV columns前的蛋白濃度需要< 70 mg/mL, 以避免造成堵塞

材料準備

CCM收集裝置
可達10,000xg的離心裝置
Amicon® Ultra centrifugal filters
Micro-pipettes
新鮮的1X PBS溶液
無菌的0.22 μm注射過濾器
無菌的針筒
Izon’s qEV columns
Izon’s AFC-V2 (Automatic Fraction Collector)

使用 qEV columns 的一般步驟

1. 準備新鮮的 1X PBS 溶液且使用0.22μm 過濾器過濾
2. 使用室溫的 PBS 溶液以平衡 qEV 管柱
    a. 除氣和室溫的緩衝液將有助於防止在凝膠床中避免形成氣泡
3. 依照使用手冊準備AFC 並將樣品輸入到表1 中列出的合適 qEV 管柱上
    a. 確認樣品的體積以確認 qEV 管柱的類型

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