關於胞外體-RNA的分析與實驗要點

CONSIDERATIONS FOR WORK WITH EXTRACELLULAR VESICLE RNA AND ITS ANALYSIS

關於胞外體-RNA的分析與實驗流程考量

EV-RNA 和 qPCR 的分析作業流程

胞外體(Extracellular Vesicles, EV)所攜帶的RNA一直是研究人員的重點項目(EV-RNA), 而其在分析或定量時會面對多種技術挑戰, 在此整理了相關流程與概念給大家。
我們提供了在胞外體提取、RNA萃取、RNA定量和以qPCR為底的測定和分析相關的思考要點來幫助研究人員克服某些挑戰並取得有意義的解釋數據
 
如流程圖所示, 第一步即是EV Isolation, 考量提示如下:
1. 必需考慮到在EV或目標樣品內, 會包含潛在的非EV結構的RNA鍵結, 例如蛋白、脂蛋白或其他不需要的EV成分
2. 使用 qEV columns (SEC) 先將非EV結構的RNA鍵結移除以純化EV是非常有效的
3. 如果需要的話(例如CCM細胞上清液原樣), 需使用 qEV Concentration Kit 濃縮試劑盒將已純化的EV再進行濃縮
4. 使用我們建議的"儲存胞外體的要點與建議"的方案以進行EV的保存, 防止EV和其RNA產生改變

第二步即是萃取EV-RNA考量提示如下:
1. 強烈建議: 使用RNase和Proteinase K將EV純化的製備進行前處理, 以保證可移除非EV的RNA汙染

2. 選擇某個均一化的策略用以放入EV樣品, 例如藉由EV數量、EV的蛋白或體積
3. 或許可考慮添加
RNA摻入裂解液以達到控制RNA萃取偏差的品管要求
4. 使用 qEV RNA Extraction Kit 萃取試劑組可得到最優化的EV-RNA純度和產量。
第三步即是EV-RNA的定量考量提示如下:
1. 或許可考慮, 
使用DNase將EV純化的製備進行前處理, 以確保可移除DNA汙染。
2. 使用螢光測定法來決定EV-RNA的濃度。
3. 使用自動電泳測定以分析EV-RNA的品質 (富集sRNAs和非大的rRNA)。
第四步即是使用RT-qPCR考量提示如下:
1. 強烈建議:  添加RNA摻入裂解液於EV-RNA中以進行均一化和/或目標RNA的定量
2. 在均一化RNA輸入中, 以RT-qPCR將EV-RNA轉化為cDNA; 如果EV-RNA的濃度是未知的, 可用RT-qPCR將EV-RNA的體積均一化或在RT-qPCR後將cDNA濃度均一化。
3. 對於SYBR或Taqman方式來說, 其需要以合適的引子
、試劑和熱循環儀從cDNA中擴增目標
4. 對EV isolation的管控
、RNA的萃取和目標RNA的定量均一化設備進行資料分析

眾所周知, RNA可調節正常的生物活動, 其也是病理性細胞失調的核心; 在細胞之間的主要溝通訊號中, 與EV關聯的RNAs(EV-RNA)可在傳送至目標細胞過程中被很好的保護著, 這可讓EV-RNA在人體中具有多種生理作用。其關鍵性不只包含特定EV-RNA的整體分析能與特定疾病有連結, 還包含特定RNA序列的存在或表達的程度可做為一個"環境"存在或發展程度的指示物, 另外, EV-RNA的腳色不只用在人類細胞中, 還延伸至例如真核細胞, 像是細菌也可能會釋放EV-RNA來影響感染期間的毒性和病原體與宿主之間的相互作用
研究人員在EV-RNA中所面臨的挑戰是: 缺乏一個標準化的EV純化與鑑定方法, 其要能可靠的提供高純度EV樣品以進行分析; 另外對於RNA的工作也存在一些固有的問題, 例如RNA萃取與分析工具的偏差會引發RNA組份的視野限制, 總之, 這些挑戰的結合會阻慢EV-RNA領域的發展。
在此, 我們提供了完整的EV-RNA作業時的實驗設計的思路, 從 EV isolation, RNA萃取到定量, 包含不同形式的測定和分析的需求-

EV ISOLATION FOR EV-RNA ANALYSIS

提取EV以進行EV-RNA的分析

Figure 1. 於含有EV粒子的樣品中的RNA鍵結的汙染物
A. 使用qEV columns(IZON)純化人類血漿後, 在富含EV粒子的餾分中以ELISA測定蛋白(Albumin)與脂蛋白(ApoA1)的汙染物含量; 其顯示了在EV粒子的製備中已經移除了大部分的蛋白和脂蛋白, 因此才能最大的降低下游的EV-RNA測定的干擾。
B. 在已去盡囊泡的FBS中, 所有讀取映照於人類基因組的RNA類別(以RNA定序分析決定); 此表列可顯示出在已去盡囊泡的FBS中殘留的RNA相關結構的貢獻, 其通常可用於從細胞上清液中的RNA通量分析。
C. 在已去盡囊泡的FBS中映照到人類基因組的最豐富的miRNAs(以RNA定序分析決定); 此表列顯示出在從細胞上清液中純化EV時, 具表徵性的miRNA圖譜只被歸因為已去盡囊泡的FBS的培養基的補充。

首先就是要先將EVs從其他非EV成分-鍵結RNA分離, 接著通常會進行濃縮以使RNA產量的數值能符合所用的RNA測定和分析法的靈敏度, 這在血漿/血清和細胞上清液(CCM)的原樣中已有很多經驗。
對於血漿的樣品來說, 大量的研究都目標在其診斷的EV標誌物, 但是其仍存在固有的挑戰: 比如其具有豐富的多樣性變化的
非EV成分-RNA鍵結, 例如血漿中包含HDL, LDL相關的miRNAs生物分子或其他類似Argonaute複合物的循環蛋白, 這些物質都會形成"干擾"。首要推薦的是以 qEV column (SEC) 來做為可靠而適合的EV純化方式, 在 Fig 1A中就顯示出其可成功的分離血漿中的EVs和HDLs(或循環蛋白複合物)。
CCM的原樣在關於內部和可變的RNA汙染物方面比血漿樣品更為單純, 然而還是有些挑戰需要克服: 因為大部分的細胞都需要供應FBS(胎牛血清)來優化生長, 而FBS本身的EVs, EV-RNA和非EV-RNA的含量都非常明顯, 通常的做法是"耗盡"用於培養的FBS-EVs, 但其卻無法完全消除所有的FBS-RNA; 事實上大約只有30%的FBS-RNA會被移除, 其餘主要是相關的RNA-蛋白鍵結; 因此, 在整個流程和每個步驟中都需要實施合適的控制方式, 例如在EV isolation的過程
、EV-RNA萃取方式、EV-RNA測定和定量等, 這都是培養中所使用的全培養基配方與細胞上清液中的重點, 如 Fig 1B&C所述
關於其他與
非EV成分的RNA鍵結類型的綜合性比較為, 不只在CCM樣品中, 同時也能於尿液、乳液和唾液的原樣中出現, 為了確保實驗結果是反應了"原始"的EV-RNA成分, 研究時就必需在樣品處理過程中將EVs和RNA的"降解"降至最低。

EV-RNA EXTRACTION

萃取EV-RNA

目前傳統有兩種EV-RNA的萃取方式, 可歸類為有機RNA萃取法和固項萃取法:
有機RNA萃取法使用phenol(苯酚)和guanidine isothiocyanate(異硫氰酸胍)來裂解EV, 然而其缺點就是這些有害物質的存在, 會偏向於長而低結構(缺乏穩定的二級結構)和低GC含量的 RNAs, 使其只能具有"中等"的 RNA 純度

固項萃取法是依賴於RNA對於固相支持物的親和力控制, 通常會以內含過濾裝置的可旋式管柱來表現; 可旋式管柱的材料已被開發成多樣化的商品式試劑組, 都各有其優缺點, 由於EVs內發現的RNA含量本身就會非常少, 可旋式管柱通常就需要使用RNA carrier(載體RNA), 一般為非相關的核酸分子, 以協助將目標RNA進行鍵結和回收。大多數的載體RNA為酵母 RNA、噬菌體 RNA、Poly (A) RNA 或糖原, 這對於偵測特定序列的PCR技術分析沒有影響; 然而其缺點是當同時存在目標RNA與載體RNA時的樣品, 在進行最後的功能應用測試研究時是否會對靶細胞造成什麼影響還未可知。
而結和以上兩種方式以進行EV-RNA的萃取現在已廣受歡迎, 原因為其被證實可顯著提高RNA製備時的產量和純度; 在進一步改良後, qEV RNA Extraction Kit (qEV RNA 萃取試劑組)
碳化矽材質的可旋式管柱不含裂解的有害物質不需要載體RNA, 能夠在沒有大小或 GC 含量偏差的情況下分離總 RNA, 並保有最佳的產率

EV-RNA QUANTIFICATION

EV-RNA的定量

Figure 2. 以自動電泳法分析的EV-RNA的RNA圖譜
A. 使用IZON qEV提取管柱純化人類血漿而得的EVs, 萃取EV-RNA後的電泳圖(灰線)- HEK293T(HEK)細胞系以紫線、而水以深藍線分別做代表用來做對照; 這表示出在EV-RNA中最豐富的RNA是小RNA, 其峰值大約於25秒出現。
B. 使用小RNA芯片萃取而得的EV-RNA的電泳圖, 其分別來自內皮細胞(上圖)和細胞上清液中的小EVs粒子(下圖); 兩個樣品都出現一個峰值, 其 miRNA會出現在10到40個核苷酸之間的片段中。
C. 使用小RNA芯片從人類血漿的EVs中萃取出EV-RNA的電泳圖; 其顯示出在血漿EVs中的miRNA分佈內含sRNAs所獨占的優勢。

一般來說, RNA的濃度可藉由分光光度計、螢光度計、常規或自動的電泳方式來分析, 然而每種方法都有其自身強度和限制, 要選擇哪種定量測定方法取決於其分析終點與條件限制之間的關聯性
經典的螢光度計或自動電泳測定方式, 分別因其特異性和靈敏度較佳而被用於EV-RNA的定量, 而要從EVs中得到RNA的數量一直是個有爭議的話題, 原因還是直接回到與所選擇的EVs純化方式有關 (在某些純化方式下, RNA會與蛋白或脂蛋白鍵結而與EVs一起被提取出), 而且要從高純度的EVs製備中也很常見到
無法檢測到 EV-RNA 濃度; 在這種情況下, 由於PCR測定的本質就是會擴增RNA的訊號, 因此以RT-qPCR的分析成功率較高
或者說, 有些定量的方式可被用來做為EV-RNA的定性分析, 例如自動電泳法的原理就是將RNA片段按照大小做快速的分離, 之後以容易呈現的格式來顯示; 在此觀念下, 了解RNA種類的大小就能指出
EV-RNA 樣本中的 rRNA、sRNA 甚至非常小的 miRNA 種類的豐度 (如 Fig. 2)。這種分析的缺點是其並非只特定為RNA的種類, 因為DNA的汙染也會和RNA一樣被偵測到, 這就是說從RNA樣品中做DNA的消化是一個選擇性但強烈推薦的步驟, 以確保可完全移除DNA的汙染; 通常是以DNase來處理RNA樣品, 在下一步的測定前適當地利用所選擇的酶以進行減活的步驟
基於18S/28S rRNA比例的指數, 自動電泳法也會被用來測定細胞RNA樣品中的RNA品質; 然而EV-RNAs主要是由小RNA組成, 只會有一點點或毫無rRNA而沒有完整的大18S/28S rRNA, 因此這些關於細胞RNA品質的測定法對於EV-RNA並不適用

Type of EV-RNAs

EV-RNAs的型態

選擇EV的純化方法對於以EV-RNA用來做診斷的潛力會產生重大的影響, 原因就是RNAs和EVs的"真實"關聯性是了解EV-RNA的生物學與其作用的重要關鍵點
廣泛而基礎的EVs-RNA鑑定可經由前面所說的自動電泳法來進行, 其輸出的結果是以
電泳圖或數字凝膠的方式呈現, 也能輕易的對EV-RNA樣品中的RNA大小做解釋; 例如, 以qEV column(SEC)來純化血漿原樣所得的EVs, 經過EV-RNA的平行分析可顯示出sRNAs的優勢和其大rRNA的缺乏 (如 Fig. 2A)
市面上各種商品試劑盒通常都具有其靈敏度以應對含量很低的EV-RNA樣品(例如 50-250 pg/L RNA濃度)或在特定RNA分佈範圍內具備更高的解析度, 比如sRNA; 其miRNA
可以和其他已知大小的sRNAs峰值保留, 可通過 20 個核苷酸標記附近的峰來做辨識 (如 Fig. 2B & 2C) 

Figure 3. 於EV-RNA中RNA生物型的相關分佈

A. 使用qEV columns(IZON)或沉澱試劑盒來純化血清所得的EVs(敗血症與健康的志願者), 包含RNA的小RNA定序結果; 從沉澱試劑盒中的樣品中觀察到最高頻率的miRNA圖譜, 其可能是因為非EV結構的miRNAs而來的。
B. 從qEV(IZON)純化血漿而得的EVs, 其包含的RNA的小RNA定序結果; 其中的基因編碼RNA(mRNA)只占了很小一部分。
C. 從內皮細胞上清液的EVs所包含的RNA的小RNA定序結果; 細胞中最豐富的 RNA 類別的映射讀數的平均百分比, EVs顯示出明顯富集的Y-RNA。

相反的, 在進行深度的EV-RNA組成的研究時通常會藉由RNA-seq方式達成, 且已被證實前期的EV純化方法的選擇會有不同的結果。如以沉澱法試劑盒進行純化則已知會連同EVs和相關的污染物一起被富集, 和SEC qEV純化的方式比較, 前者用於血清樣品中會顯示出較高的相對miRNA生物含量 (如 Fig. 3A)。這種純度不高的EV在研究文獻中已表示會"高估"miRNA數值, 比如其在血漿/血清中的循環miRNAs的富集其實是與脂蛋白和雜蛋白相關的
進一步說, 在以更可靠的純化方式例如SEC-qEVs得到血漿-EVs後, 以小RNA-seq分析方式可顯示出其主要的EV-RNA內含物是miRNA, 同時只有小部份是基因編碼RNAs (如 Fig. 3B)
依照從不同的細胞線所得的細胞上清液(CCM)裡的EV-RNA, 其組成會呈現出很大程度的可變性; 從內皮細胞CCM的EV提取後的RNA圖譜展示了miRNA的富集然而與細胞對應物相比,EV中的Y-RNA也有出現大量富集(如 Fig. 3C)。Y-RNA是一個被認為是中型的RNA, 可從許多不同的體外細胞型態的EVs中鑑定出, 包含生物檢體, 其存在激發了人們對研究EV的作用和診斷潛力的興趣

EV-RNA Analysis

EV-RNA的分析

EV-RNA分析做為快速成長的一個新技術, 可應用於例如細胞生物學的領域中, 也被快速的調整至EV的整體流程中

Figure 4. 使用RT-qPCR偵測血漿的EV-RNA的3個miRNA和3個mRNA目標物; 其是經由qEV columns(IZON)純化而得的EVs, 之後使用了qEV RNA Extraction Kit而得到的EV-RNA; 分別使用的是Taqman法偵測miRNA目標物和SYBR法偵測mRNA目標物。
這表示兩種RNA目標物的類型都可輕易的在EV-RNA樣品中偵測到 (其顯示出之前的RNA產率會低於所選的螢光測定的偵測極限)。

PCR

定量PCR(qPCR)在EV-RNA研究中表現出很多的優點, 具備快速、穩固、可重複和高靈敏和高特異的方式; 如前述, 依照內含EV複合物的來源和起始體積的不同, 普遍的定論是EV-RNA的產率會低於偵測極限, 就算使用了最靈敏的RNA定量工具也是如此, 然而經由PCR為底的測定而擴增的訊號, 依其豐度可能使某些目標能被成功的偵測到。
為了避免檢測不到RNA的數量, 我們可以添加已知含量的外源RNA(spike-in), 以做為品管和均一化目的; 例如在RNA萃取前加入同等數量的外源RNA於不同的EV裂解物中, 即可用來計算在RNA萃取過程內的特定RNA非可控變異和偏差, 而在qPCR前添加外源RNA到EV樣品中可允許目標RNA的均一化, 當RNA spike-in用作標準曲線時可進行絕對定量。
為了解釋基於在萃取EV-RNA或PCR時的參數的潛在偏差, 這些 RNAs spike-in 可做為兩個步驟的品質管控:
1. 必須能代表 EV 中發現的不同類型 RNA 的特徵
2. 或者至少代表目標 RNA 在長度、結構、GC 含量方面的特徵
用於均一化的常見合成 RNA 寡核苷酸的序列與內源性 EV-RNA 不同, 例如來自秀麗隱桿線蟲的miRNA, 都可在市面上買到。

在進行qPCR之前會有一個步驟是涉及在反轉錄酶(RT)介導的反應中將EV-RNA轉化為其"互補DNA(cDNA)"; 不同的RTs會有不同的屬性, 例如RNase活性, 保真度, 熱穩定性或其過程性, 而最佳的RT選擇將會視實驗需求而定

如果EV-RNA的濃度是已知的, 那後續的整體方案就會要求對每個 cDNA 反應的EV-RNA輸入進行均一化; 通常用來cDNA合成的EV-RNA的輸入數量可能會在10 pg到5 µg的範圍, 這取決於RT的表現
如果EV-RNA的濃度是未知的, 那麼可以將
EV-RNA 均一化為具有相同實驗方案的樣品中的體積或spike-in RNA(在 RT 反應之前添加到 RNA中), RTs現在都可買到, 有的是只有酶, 有的是包含RT, dNTPs, 引子和緩衝液的cDNA試劑組
在cDNA反應後就會以PCR進行擴增和定量; 在此, PCR
使用了兩種主要的擴增檢測化學或技術: SYBR Green或Taqman probes
SYBR Green是一種螢光染料, 可在PCR反應時的放大過程中非特異性的結合任何雙鏈DNA; Taqman方式則是利用一個能在放大過程時與發出螢光的染料結合的序列特異性探針。
雖然qPCR的研究顯示出在EVs中包含了mRNA和sRNA(含miRNA), 如 Fig. 4 所述, 在以PCR為基礎的測定中, 目標miRNA普遍在EV內的含量非常豐富, 這可
對其在診斷的潛力和用來監視的作用進行更徹底的調查
接下來的PCR技術雖然還不普遍的應用於實驗室中, 但
因其擁有超高靈敏度和絕對的定量能力, 已經於EV-RNA有更顯著的用途 - 這就是 Droplet Digital PCR (ddPCR); 通常來說此法可從一個常規的PCR反應中產生約20,000個"飛沫"或小PCR反應, 接著會定量其陽性飛沫, 此項和EV研究特別相關的技術目標是優化癌症的診斷能力, 因為一般情況下都會因為缺乏標記物而太晚被發現, 例如肝癌, 現在已經可用ddPCR協助偵測到在已優化的特異性捕捉癌症特異EVs中的標誌性RNA, 以做到早期診斷。

RNA sequencing

RNA定序

RNA定序(RNA-seq)是研究EV-RNA和其潛力時的一項強力的技術, 此項定量與定性的技術並不限於已知的RNA序列或結構
然而, 在應用於EV領域中, 尤其在有些使用超長時間的EV提取方式和在沒這麼好的儲存條件下所造成的EV-RNA含量降低時, 或是從超高純度的EV中所萃取出超低數量RNA下, RNA-seq技術是可以被質疑的; 所以在每種包含EV的檢體中, 有些特定的考量就需要於RNA-seq中被提出討論, 這是研究人員要在RNA-seq前要做的事
因為有些情況下會得到超低數量的EV-RNA, 此時會建議使用RNA-seq實驗室專用試劑盒來濃縮EV-RNA以達到濃度需求和輸入的體積; 
和PCRs一樣, 特別是在處理關於從不同種類的檢體中的EV-RNA過程時的非可控變異時, RNA spike-in可被用來均一化RNA-seq的資料, 而EV-RNA的品質一直扮演著重要的腳色, 在RNA-seq前, 以自動電泳法分析可於EV-RNA品質管控中提供強大的實用性。
建議是, 在一個EV-RNA流程中出現相對豐度>1%的miRNA和缺乏大18S/28S rRNAs物種的情況下, 才代表著是sRNA富集和成功的小RNA-seq資料庫製造的良好指標。
特異的小RNA-seq資料庫製備套組已被廣泛使用, 且總RNA-seq資料庫製備套組也已被用於EV-RNA; RNA-seq資料庫製備套組通常需要1-1000 ng範圍的總EV-RNA輸入, 或是在10 pg -1000 ng範圍內的EV-sRNA富集, 其重懸於3-10 
µ
L的水中; 另外, 有些小RNA-seq資料庫套組可從總RNA樣品中製備sRNA, 而/或允許miRNAs被當作特異的目標。
必需注意的是在資料庫製備過程中也不可避免的會出現偏差: 包含EV-RNA adapter連結步驟和cDNA大小的選擇; 總之, RNA-seq是一個非常強大的工具, 但一定要和其他的研究做整體的計劃
、解釋和數據比較

Microarrays

微陣列

雖然前面所述的RNA-seq提供了最完整的EV-RNA成分的分析, 在整體的方案中仍有幾個可被質疑的地方, 尤其是需要先進的知識和技巧; 在此情形下, 對於特定RNA分佈的預先定性和相對定量, 微陣列就提供了一個單純的選擇, 例如可用miRNA微陣列在 EV-RNA 中調查最廣泛的RNA的分佈情況
已經有好幾種商品化的miRNA微陣列試劑組出現於市場上, 包含各種數量的miRNA探針(15,000 - 30,000), miRNAs的種類(已熟或pre-miRNA), 線性範圍(
覆蓋 3 到 4 個對數差異), 總RNA的輸入(從100至500 ng RNA)或單個陣列中覆蓋的生物體(人、小鼠、大鼠)
因為微陣列不是一個絕對的定量工具, 所以在進行之前就必需設計關於均一化的策略; 而因其在EV-RNA中的比例較低, 在EV研究中的以微陣列為基礎的mRNA基因表達譜可能不太常見, 然而其也被舉證過, 應用於健康與癌症患者的血清和尿液EV中發現了不同的基因表達, 以表示其具有診斷的潛力。

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