儲存胞外體的要點與建議

HOW TO STORE EXTRACELLULAR VESICLES

橫跨各式樣品來源的胞外體儲存的建議與要點

Extracellular vesicles (EVs, 胞外體/細胞外囊泡)幾乎可以被任何活細胞釋放, 包含複雜的多細胞真核生物(人體)或單細胞原生寄生蟲(細菌、植物和真菌)等, 對於現有的理解是, EVs在這些生物體中的獨特分子組成和其作用是非常的多樣化, 這種特點帶來了專門為研究EVs而定的基礎性和動機。

眾所周知, EVs可被發現存在於體內和體外環境內, 是屬於奈米/濃度等級與複合性流體的範疇, 其任何關於EVs的分析最關鍵的步驟就是”提取”方式(isolation)的考量。
經由提取(純化)後, 除非可以保證能新鮮的立刻做各種分析, 否則就需要長期或短期的暫時保存。為了能使結果能夠充分反應出EVs的原有生理狀態, 研究計畫時就必須能對於包含樣品收集、處理和提取(純化)等各種分析前的步驟並
不會影響EVs的回收率、物理性質和生物性功能有充分的信心。

已經有許多的報導是關於在各種EVs分析前的”保存方式”會對下游分析結果產生影響: 事實上, 在不同的處理、儲存和提取方式所產生的巨大變化是在EVs研究中的一個主要障礙, 因此, 提供一個對於提取(純化)和保存的”標準化”方案以維持EVs功能性和完整度, 之後結合某些穩健可靠的表徵(分析)方法對於獲得高重複度和高準確度的結果就是必需的。

關於胞外體提取"後"的一般性建議

  • 應使用”矽化製容器”, 以避免EVs製備時黏附於容器壁上

  • PBS緩衝液是最普遍使用來做為EVs的重懸和儲存, 而其他緩衝液例如HBSS或Tris緩衝鹽水也可適用。

  • 使用-80度冷凍儲存在緩衝液中的EVs是一個可信的方法, 如用更高的溫度(-70度以上)儲存則已被證實會對囊泡的特性有顯著影響。

  • 如可加入”冷凍保護劑”則會對儲存EVs的緩衝液有幫助, 報導已證實和反覆凍融的PBS相比, 海藻糖可增加小EVs和其所攜貨物(蛋白, RNA)的穩定性。

Effect of Trehalose on storage of purified EVs. (A) Automated electrophoresis analysis of exosome-sized EV protein profiles under reducing conditions and stored with and without Trehalose, (B) TNF-alpha cytokine secretion of macrophages stimulated with Exosome-sized EVs stored with and without Trehalose.

在此我們提供了在最常使用的生物流體中的EVs在提取(純化)”前”與”後”的各種思路來幫助研究者們達到可重複和可靠的最佳化結果; 分為血液尿液乳液支氣管肺泡灌洗液精液唾液細胞培養上清液, 用戶可依照自行的樣品類型做參閱:

血液

提取胞外體"前"的考量

  • 傳統上會推薦使用抗凝劑檸檬酸鹽, 因其對於小EVs中的穩定性高。然而最近的報導已提拱了其他的EVs分佈所造成影響的更多內容, 血液收集試管的選擇同時會影響EVs的顯著變化和下游分析結果, 例如肝素和EDTA殘留物可能會在樣品中並干擾PCR反應。

  • 報導指出, 在檸檬酸鹽或肝素管中收集的未處理全血中的小EVs會於3小時後顯著增加; 如果未能及時去除細胞, 為了產生多餘的小EVs, 這邊推薦使用”EDTA”試管取代。

  • 如果血小板衍生的EVs不是研究的目標, 那就必須要快速而完全的去除血小板。以1,550xg/20 mins室溫下離心的步驟是無法完全去除血小板的, 各種研究報導推薦的典型步驟是2,500xg/20 mins室溫下離心兩次, 也可以單次的以5,000xg/20 mins室溫下離心, 這並不會影響EVs的回收率。

  • 在無血小板-EVs的血漿樣品中, 要盡量避免活化血小板以避免其EVs釋放到樣品中。在報導中, 如果沒有在1小時內去除細胞, 與肝素試管相比, 檸檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤 (CPDA) 和 EDTA 試管都可顯著降低小EVs的回收率, 而另些報導顯示, 在未經檸檬酸鈉和肝素試管中進行的血液處理下, 小EVs可在室溫穩定維持4小時, 而在檸檬酸鹽或EDTA試管下, 小EVs會在3小時後呈現顯著的增加; 以上的報導都藉由特定代的骨隨EVs解釋, 在EDTA試管中並沒有特定的增加小EVs。

  • 如果能夠”立刻”的處理的話, 每種血液收集試管內的血漿-EVs濃度都不會受到影響, 然而在結構方面, 相比於酸性檸檬酸葡萄糖(ACD)和EDTA試管, 檸檬酸鹽試管就存在著許多血小板-EVs。

  • 關於血漿和血清來源的EVs組成是不同的, 如果採血試管中不含抗凝血劑, 那麼對於所有的血清樣品來說, 即可提供血清-EVs的重要數量。

  • 小EVs已被報導為可以維持其濃度在-20至-160度時儲存很長的時間, 然而其卻會室溫或4度下的儲存時增加濃度。而在-80度下儲存, 貧血血漿的小EVs濃度會增加, 這代表了如完全去除了血小板將可避免”人為”製的小EVs出現。

  • 反覆凍融血清樣品被證實其會顯著增加小EVs中的DNA含量, 但不影響EVs濃度, 因此我們建議在冷凍儲存前將樣品進行”分裝”。

  • 在長時間的-80度血漿(無細胞)儲存下可避免小EVs的顆粒、蛋白和核酸團聚, 包含小EVs的顯著增加。

  • 將小EVs”凍乾”和非凍乾相比, 小EVs的生物活性會維持其穩定性, 然而並沒有關於小EVs的濃度/完整性的測試, 推測其生物活性可能與非EV成分相關。

Effect of RT incubation time of blood sample before initial centrifugation. Exosomesized EV concentration is presented as transformed relative intensities from protein array against CD9, CD63, and/or CD81 markers.

Effect of storage temperature (months) on plasma samples. Exosome-sized EV concentration is presented as transformed relative intensities from protein array against CD9, CD63, and/or CD81 markers.

血液

提取胞外體"後"的考量

  • 儲存於-20度, -80度或-196度一年以上時, 純化後的血小板/紅血球-EVs都可顯示顆粒計數的穩定性。

  • 在單次的凍融時, 並不會影響純化的血漿外泌體大小的EVs其完整性。

  • 當提取後的血漿EVs儲存於-80度時, 其內的RNA可穩定維持12年。

  • 當收集血液後立刻提取血漿外泌體大小的EVs時, 可在-80度下維持其型態和功能性。

尿液

提取胞外體"前"的考量

  • 不論是每天的第一次或第二次的尿液樣品, 或是清晨與中午時段的樣品, 都有報導指出其尿液EVs的數量都是相似的, 都可採用。

  • 應該在整體尿液源樣收集完成立刻加入蛋白酶抑制劑(PI), 否則即使冷凍儲存還是會造成膜結合蛋白和小EVs(Exosome)的顯著降解。

  • 尿液EVs通常會在原樣收集後的2小時內降解, 因此原樣收集後應該盡快進行實驗或冷凍保存。

  • 操作尿液的實驗過程中應該維持在室溫或37度下, 如是在4度或更低的溫度時會促使尿調節素聚集和EVs回收率的損失, 而若是已經冷凍的樣品則應該維持在4度下處理。

  • 最初的處理為在室溫下使用17,000xg/10-15 mins的離心以去除細胞、大型碎屑和大型EVs, 而如果目標是小EVs, 則可以調整為2,000xg離心即可去除細胞和碎屑。

  • 已經有研究使用不同的方式來消除尿調節素, 例如在低速離心後加入DTT(37度, 放置5分鐘)以解聚尿調節素, 進而做另一個17,0000xg的離心將其移除以提高EVs回收率, 這與原始的尿液樣品儲存溫度無關。將新鮮尿液樣品以ZnSO4(1至4mM)處理, 可有效的在EVs製備時降低尿調節素的汙染; 而其他的研究中也有在高速重懸的EVs中加入CHAPS以降低尿調節素, 同時保持EV的功能性。

  • 在無細胞狀態下的尿液中, 單次的凍融循環會顯著的降低EV濃度, 因此需要盡可能減少凍融循環, 並針對單獨樣品冷凍前和後的分析結果進行評估。

  • 尿液樣品應該儲存於-80度中, 如是在更高的溫度時(例如-20度)就會引起EVs的增加或減少。

  • -80度冷凍的尿液樣品內的EVs回收可藉由劇烈的樣品震盪以將附著於試管的EVs分離。

Effect of DTT treatment on storage temperature and removal of Tamm-Horsfall protein in EVs from unprocessed urine samples. (A) Immunoblots of 17,000 and 200,000 × g pellets showing only fresh processing of urine samples returns no exosomal markers in treated 17,000 × g pellets, and presence of exosomal markers in untreated 17,000 × g pellets, regardless of storage temperature of urine. Electron microscope images of the 17,000 × g pellets (B) without DTT and (C) with DTT showing short convoluted THP oligomers in untreated samples.

尿液

提取胞外體"後"的考量

  • 在-80度儲存下, 懸浮在緩衝液中的尿液EVs可保有正常的狀態、表面標記物和粒徑分佈。

  • 最多數經提取後的尿液EVs都會儲存在PBS下, 推薦實驗時將其放置於冰上。

乳液

提取胞外體"前"的考量

  • 如果不是立刻要做提取EVs的話, 建議是將乳液內的細胞和奶油層去除後純存於-80度下。

  • 最初的細胞/奶油層通常以3000xg室溫離心以去除, 而接下來的離心應該在4度下進行。

  • 在每次為了儲存或接續處理而轉移上清液前, 也必須注意脂肪層或脂肪球的移除。

  • 在高酪蛋白牛奶樣品中(例如牛, 羊), 提取EVs會變更更加困難, 建議做一些處置以移除酪蛋白; 在低速離心的上清液中加入EDTA, 醋酸或鹽酸處理可協助改善酪蛋白團聚, 並接續可做5000xg離心以將其去除, 但是要注意的是, 在這種低pH值下, 也可影響EVs的表面標記物。

  • “冷凍”會破壞牛奶的脂肪/水乳液狀這可能會影響到EVs的提取(純度), 然而在冷凍前移除潛在的壓力釋放EVs來源還是為一個合適的作法。

乳液

提取胞外體"後"的考量

  • 在-80度放置4周至18個月下, 牛乳的小EVs可維持不變(包含其物理特定和生物活性)

  • 在4度放置最多10天, 人類乳液的小EVs其粒徑增加, 這顯示其顆粒出現了某些膨脹或團聚。

支氣管肺泡灌洗液(BALF)

提取胞外體"前"的考量

  • 推薦低速離心以去除細胞, 這可能也能將任何BALF的黏液塞去除。

  • 冷凍BALF樣品已被報導證實會產生團聚, 因次建議是立刻新鮮的進行EVs提取。

  • 在-80度下, BALF的細菌生長會被抑制, 所以應在此條件下儲存以避免細菌衍生EVs增加和目標EVs的降解減少。

支氣管肺泡灌洗液(BALF)

提取胞外體"後"的考量

  • 在-80度時的PBS重懸中的BALF-sEVs會表現出小EVs的粒徑、數量的增加和Zeta potential的降低; 而若在4度下則其影響會小的多, 因此推薦保存於4度。

  • 有些研究會建議在已純化的BALF製劑中使用一般的超聲波(水浴)處理, 這可協助降低冷凍儲存造成的團聚。

  • 在實驗中, EVs提取需在冰上進行, 如是在室溫下處理和儲存將會顯著的影響囊泡的Zeta potential。

精液

提取胞外體"前"的考量

  • 在-80度的長時間保存下(30年), 精液EVs可顯示出穩定的型態、濃度和粒徑, 然而其無法維持完整的EVs相關的酶活性。

  • 可行的話, 建議是在儲存前先進行細胞移除; 可將收集來的新鮮精液在室溫下液化20-30 min, 接著在4度下以1000xg/10 min離心以將精子和大片未溶解的精液凝膠聚團, 接著儲放精漿於-80度直到要進行EVs提取。

  • 已有報導稱可見光會影響人類和動物的精子, 因此需要注意的是, 所有的精液樣品在分析前都要維持在暗室中。

精液

提取胞外體"後"的考量

  • 精液小EVs於PBS的-80度下可顯示良好和正常的完整度。

唾液

提取胞外體"前"的考量

  • 通常可加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白降解, 但至今尚無精確的報導可以舉證其對於EVs回收率的影響。

  • 因唾液的黏性, 在處理樣品(過濾, 離心)前推薦以1:1的比率加入PBS或Tris緩衝鹽水做稀釋。

  • 在提取和儲存前, 建議在低速離心下去除細胞。

  • 將無細胞的唾液儲存於4度, 可確保長達一個月的sEV完整度和生物活性。

  • 研究者通常會將唾液樣品維持在冰上或於4度離心, 這可使人為造成的細胞sEV出現的可能性大大降低。

  • 如果無法立刻提取EVs, 建議放置於-80度下。

唾液

提取胞外體"後"的考量

  • 於-20度或-80度下, sEV會顯示有穩定的EV結構, 但其原有的生物活性卻有顯著的受損, 所以建議在非冷凍的條件下使用(4度)。

  • 對於唾液EVs, PBS是最常使用的緩衝液。

細胞上清液(CCM)

提取胞外體"前"的考量

  • 胎牛血清(FBS)是最常使用於細胞培養的添加物, 這當然要列入考慮的是FBS-EVs會與目標EVs一起被提取出; 相較於不加FBS(會影響細胞生長和其EVs釋放), 建議是以”無EVs”的FBS取代(可自行製作或購買)。

  • CCM-EVs提取前的考量是細胞死亡, 這會引起刺激誘導的細胞或死細胞衍生的EVs出現造成干擾, 因此建議實驗室於提取前需進行細胞活性的測量。

  • 大多數的微生物汙染會很快速地出現在細胞培養中, 因為細菌可在培養後的4-6小時內長出是眾所周知的, 還有其他微生物汙染例如支原體, 其可具有休眠時段而導致細胞培養時的幾天或好幾周的時間都無法發現。

  • 推薦在儲存前先進行細胞和大碎屑移除, 以防止人為的細胞EVs出現和已存在的EVs降解。

細胞上清液(CCM)

提取胞外體"後"的考量

  • 現已被舉證的是, 將sEV儲存在-80度, -20度或4度下一週時間都可維持EVs濃度。

  • 已有報導其在-80度儲存下可穩定sEV內的RNA貨物(miRNAs), 因其對於溫度非常敏感, 無論在-20度或4度下都會有顯著的減少。

  • 將EVs儲存在培養液中2-3個月時對於sEV-RNA貨物的影響可忽略不計, 然而如果是更長的時間, 例如2年以上, 就會引起顯著的sEV-RNA降解。 在EVs提取後的培養液儲存中提供10% DMSO可顯示出其對於EVs的粒徑和完整度的保護, 然而其不能補救EVs-RNA的降解。

  • 類似從CCM來源的大EVs顆粒, 也有了其在不同儲存條件的評估, 可看出其更加敏感, 在4度下放置一週或1個月會降低EVs的數量。

Effect of freezing storage conditions of EVs on EV-RNA cargo. Results of capillary electrophoresis of exosome-sized EV RNA isolated from frozen EVs stored at −80 °C in media alone (A) or stored at −196 °C with 5–10% DMSO (B), show a left shift in nucleotide size towards small, degraded RNA at 2 years pf storage.

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